FYZIOLOGIE BUNĚČNÝCH SYSTÉMŮ Doc. RNDr. Kozubík Alois, CSc. - Doc. RNDr. Hofmanová Jiřina, CSc.

SYLABUS pro studenty 4. ročníku fyziologie živočichů a obecné zoologie, mol. biologie, chemie životního prostředí a ekotoxikologie, výběrová přednáška pro doktorandy n  - Stručný úvod do teorie systémů n  - Negativní a pozitivní zpětná vazba n   - Základní pojmy, parametry cytokinetiky (proliferace, diferenciace, apoptóza) n   - Typy buněčných populací n   - Kmenové a diferencované kompartmenty. Totipotentní, pluripotentní, progenitorové, komitované diferencované buněčné populace n   - Autokrinní, parakrinní a endokrinní regulace n   - Buněčný cyklus a jeho regulace n   - Faktory ovlivňující buněčné dělení, cytokiny, růstové faktory a inhibitory, jejich specifita a rovnováha jejich působení n   - Struktura plasmatické membrány a její funkce v regulaci buněčné proliferace a diferenciace n   - Vysoce nenasycené mastné kyseliny a eikosanoidy n   - Transdukce signálů a exprese genetické informace n   - Úloha fosfolipidových komponet v transdukci signálů růst modulujících látek n   - Mechanismus účinku hormonů a tkáňových mediátorů ( cytokiny a "chalony"). n   - Regulace proliferace, diferenciace, apoptózy  

Homeostáza, zdraví a nemoc Krvetvorný systém a jeho funkce n   Hemopoéza ( lymfopoéza, myelopoéza, erytropoéza, megakaryocytopoéza ) n   Funkce diferencovaných krevních elementů - monocyty, makrofágy - fagocytóza; T B lymfocyty - imunita n   Membránové rozpoznávací systémy buněk imunitní soustava n   Tvorba protilátek ( mechanismus a dynamika vzniku, příprava monoklonálních protilátek ) n   Sekreční a regulační funkce buněk imunitního systému n   Vztah imunitního systému k dalším fyziologickým funkcím ( zánětu apod.)   Homeostáza, zdraví a nemoc n   Organismus jako hierarchický systém, spolupůsobení nervové, endokrinní a humorální soustavy n   Příklady systémových reakcí jako jsou stres, zánět apod. a jejich význam z hlediska zdraví a nemoci n   Škodlivé faktory vnějšího prostředí a jejich vliv na zdraví lidské populace  

Doporučená literatura Cell Physiology Source Book, ed. N. Sperelakis Academic Press Inc., 1995 B. Alberts et al.: Molecular Biology of the Cell, 3rd edition, Garland Publish. Inc., New York 1994 Biochemie, B., Voet, J.G. Voetová: Victoria Publishing, Praha, 1990 Molecular Cell biology, J.E. Darnell: Eds. Darnell, Lodish, Baltimore, 2nd edition, Scientific American Books Inc., New York 1990 J. Neuwirt, E. Nečas: Kmenové buňky a krevní choroby, Avicenum Praha 1981 Základy buněčné biologie – úvod do molekulární biologie buňky, B. Alberts, D. Bray, A, Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, Espero Publishing, (orig. 1998) Klinická imunologie, J. Krejsek, O. Kopecký, Nucleus HK, 2004 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ J. Vácha: Problém normálnosti v biologii a lékařství, Avicenum, Praha 1980 J. Šterzl: Imunitní systém a jeho fyziologické funkce, Čs. Imunol. Společnost, Praha 1993

čas množství informace (kvantita) (kvalita) využitelnost informace „Moudrost člověka lze měřit podle starostlivosti, s níž myslí na věci budoucí nebo na konec.“ G. Ch. Lichtenberg

studium na jednotlivých úrovních organizace systému organismální, tkáňová buněčná molekulová studium na jednotlivých úrovních organizace systému

VÝZKUMNÉ CÍLE A OBLASTI PRAKTICKÉHO VYUŽITÍ ONKOGENEZE fáze: PODPŮRNÁ (PROMOTION) INICIAČNÍ (INITIATION) „cell signalling“ (cytokiny vs. eikosanoidy) POPULACE NORMÁLNÍCH (NETRANSFORMOVANÝCH) BUNĚK POPULACE TRANSFORMOVANÝCH BUNĚK PROGRESIVNÍ FÁZE (PROGRESSION) klinická data, matematické analýzy, experimentální ověření ONKOTERAPIE

Typy regulací 1) Hormonální (endokrinní) regulace růstu a buněčných funkcí) 1) Hormonální (endokrinní) regulace Regulátor – hormon je produkován bu ňkami žláz s vnit řní sekrecí do krevního řečiště . Ovliv ňuje funkce buněk, které mohou být značně vzdáleny od míst syntézy hormonu . Hormon – je tedy produkován za ú čelem kontroly činnosti buněk než těch, které jej produkují 2) Parakrinní regulace Mechanismus p ůsobení spočívá v tom, že růstový faktor (regulátor) – tkáňový mediátor (regulátor místního p ůsobení) – je syntetizován jedním typem bun ěk , poté je transportován do extracelulárního prostoru a ovliv ňuje f-ce buněk v nejbli žším okolí . ( často jediná možnost vzhledem k velmi krátkému polo času rozpadu) 3) Autokrinní regulace je mo žná tehdy, jestliže jsou bu ňky schopny jak syntetizovat tak i reagovat na určitý (růstový) regulátor. Pozn. : autokrinní model je sou částí konceptu vysvětlujícího abnormální regulaci nádorového r ůstu. P ředpokládá, že nádorov ě změněné buňky produkují stimulační růstové faktory v nadm ěrném mno žství, na které samy odpovídají . Tak se autostimulují ve smyslu aktivace proliferace.

Apoptóza: Nekróza: Proliferace: Diferenciace: Růst programovaná buněčná smrt, nevede k zánětu Nekróza: neprogramovaná buněčná smrt, je příčinou zánětu (odlišný průběh biochemických reakcí, rozdílná morfologie) Proliferace: je ekvivalentem bun ěčného dělení ( tzn. zvýšení po čtu kvalitativně totožných buněk) Diferenciace: „rozr ůzňování buněk“ (vznik kvalitativně odlišných buněk ) Růst zv ětšení „objemu“ buňky, buněčné populace (tkáně nebo organismu). Je d ůsledkem: a) zv ětšení velikosti buněk při zachování konstantní velikosti populace b) zv ětšení počtu buněk (proliferace) bez změn v objemu bun ěk c) zvýšení po čtu buněk i jejich objemu d) odumírání apoptózou nebo nekrózou

TYPY BUNĚČNÝCH POPULACÍ TYPY PROLIFERUJÍCÍ NÁDOR expandující, neopouštějí populaci, množí se K. B. populace coby zdroj buněk pro jiné populace c. konstantní BLASTY KRVE tranzitní populace ve které se buňky pomnoží c. konstantní TYPY BUNĚČNÝCH POPULACÍ podle Gilberta a Lajthy (1965) TYPY NEPROLIFERUJÍCÍ OOCYTY stále ubývá metamyelocyty k. d. ery. gran. c. konstantní typ průchozí (tranzitní) B. C.N.S. stacionární c. konstantní

MODELY: Buňky tzv. intenzívně proliferujících populací (zejména b. krvetvorné a b. střevních epitelů). a buňky nádorové

Polyklonální charakter kostních buněk řirovnání kmenové buňky ke stromu: a – kmenová bu ňka v embryonální době b – kmenová buňka v dospělosti a

Seznam používaných zkratek kmenových buněk: BFU-E - burst forming unit - erythroid (jednotka vytvá řející explozivně vznikající kolonie erytroidní řady). Velmi nezralá kmenová bu ňka erytroidní řady. CFU-BL - colony forming cell - B - lymfocyte (bu ňka vytvářející kolonie lymfocytů B). CFU-C - colony forming unit - culture (jednotky vytvá řející kolonie v kultuře). (GM-CFC) Kmenová bu ňka bílé řady, v poslední dob ě stále častěji používaná zkratka GM-CFC – granulocyty macrophage-colony forming cell (bu ňka vutvářející kolonie pro granulocyty a makrofágy). CFU-E - colony forming unit - erythroid (jednotka vutvá řející kolonie erytroidní řady.) . Kmenová bu ňka erytroidní řady CFU-Meg- c olony forming unit - megakaryocyte (jednotka vytvá řející kolonie megakaryocytů). Kmenová bu ňka erytroidní řady. CFU-S - colony forming unit - spleen (jednotka vytvá řející kolonie ve lsezině). (CFU - Nejb ěžnější používaná zkratka pro hemopoetickou pluripotentní kmenovou buňku. GEMM) DCPC – diffusion chamber progenitor cell (kemnová progenitorová bu ňka proliferující v difúzních kom ůrkách.)

Pluripotent Self-renewing Stem Cells T.M.Dexter and M.Moore STEM CELL COMPARTMENT PROGENITOR CELL COMPARTMENT MATURE („END“) CELL COMPARTMENT Pre-T cells T-cells Eos-CSF Eos-CFC Eosinophils BPA IL-3 (HCGF) Epo BFU-E Pluripotent Self-renewing Stem Cells CFU-E RBC GM-CSF¨s CFU-S CFC-Mix GM-CFC Neutrophils Macrophages Meg-CSF´s IL-3 (HCGF) Megakaryocytes/ Platelets Meg-CFC MCGF Bas-CFC Basophils/Mast cells Pre-B cells B-cells SELF-RENEWAL CAPACITY DIFFERENTIATION AND DEVELOPMENT Fig. 1. The structure of the hemopoietic system

Kompartmenty D ůsledek kompartmentace : P říklady: funk čně nebo prostorově oddělené soubory prvků (složek). D ůsledek kompartmentace : (existence jednotlivých kompartment ů) prvky (např. látky nebo bu ňky) jsou nerovnoměrně rozděleny. P říklady: všechny membránami ohrani čené struktury mají (z hlediska rozdělení látek) „své vnitřní prost ředí“ a selektivn ě akumulují nebo zadržují určité látky proti koncentra čnímu spádu. U ž tímto prostým faktem jsou některé reakce umožněny, jiným může být zabráněno. Tato protientropická distribuce molekul v bu ňce směřující proti neuspořádanosti má velký význam pro bun ěčný metabolismus a regulace. Umo žňuje ji právě existence bun ěčných membrán – jeden ze základ ů biologických systémů Bude rozvedeno později

Hematopoetické buňky kostní dřeně Pluripotentní buňka již neschopná vytvořit slezinnou kolonii 1 - BFU-E - CFU-E - CFU-C - CFU-eozinofilů - CFU-Meg - CFU-makrofágů2 - CFU-BL3 - CFU-TL3 erytroblasty - myelocyty - megakaryocyty 100 % Hematopoetické buňky kostní dřeně 50 % Přestup do krve CFU-S 0 % Pluripotentní buňky Morfologicky rozpoznatelné buňky Proliferující buňky Neproliferující buňky Obr. 8. Schéma kvantitativního zastoupení různých prekurzorů krevních buněk v krvetvorné tkáni. 1Podle Gregorové a Henkelmana (1977); 2podle MacVittieho a Porvaznika (1978); 3nejsou odvozeny od CFU-S.

POČET BUNĚK V POPULACI diferenciacezánik buněk zvýšené riziko vzniku nádorových onemocnění (smrt apoptózou) tolerovaná hranice regulovaného rozmezí POČET BUNĚK V POPULACI optimální rozsah regulace „homeostázy“ na tkáňové úrovni produkce buněk (intenzita dělení - proliferace)

- + hranice (limity): přírůstek buněk (intenzita dělení) základní stav („normalita“) před ovlivněním buněčné populace regenerativní zvýšení úrovně buněčného dělení nová úroveň rovnováhy (vysoký „obrat“ buň. populace) (vznik nádorového onemocnění) hyperplazie cytotoxické působení mitogenní stimulace + hranice (limity): přírůstek buněk (intenzita dělení) zvýšení rizika optimálního rozmezí optimum optimálního rozmezí (nekróza, apoptóza) úbytek buněk nevratného poškození - rovnovážný stav nerovnovážný stav

+ - ? % t0 tx time (t) differentiation apoptosis (necrosis) proliferation t0 tx time (t)

Rovnováha (homeostáza) výsledek působení mnohočetných zpětných vazeb

- + růst FAKTORY SPECIFICKÉ FAKTORY NESPECIFICKÉ jádro (DNA) membrána cytosol

REGULACE „NORMÁLNÍHO“ RŮSTU Startovací stimulátorová síla (odpověď vše nebo nic) INHIBICE kumulace katabolitů vyčerpání živin transmem.pot. Em -70 až -90 mV limitní konc. Na+/K+, Ca2+, Mg2+ snížení cGMP~10-8-10-12 mol.l-1 intracel. zvýšení cAMP 10-2-10-5 mol.l-1 extr. katabolické steroidy interferon katecholaminy, adrenalin některé mitostat. hormony ACTH některé prostaglandiny inh. myeloidní leukémie inh. epid. karcinomu, ascitu inh. lymfomu, melanomu epidermální, intestinální inh. FGRF, MCIF inh. Atd. BSC-1, BHK-1 inh spec. inhibitory-chalony spec. endogenní inhibitory spec. intracel. stim. proteiny spec. růstové faktory růstové proteiny, kondic.média poietiny, CSF lektiny (A, conc. A) somatomediny některé prostaglandiny EGF, FGF, NGF, MSA atd. některé hormony - mitogenní inzulín, serotonín hydrokortizon, noradrenalin anbolické steroidy zvýšení cGMP 10-3-10-6mol.l-1 extr. snížení cAMP pod 10-8 mol.l-1 i.c. dodání Ca2+ nad 1,8 mV transmem. pot. Em -10 až -70 mV proteázy, trypsinizace dodání živin odstránění katabolitů Mono- Nesspecifické faktory R Ů S T Oligo- Poly- Poly- Oligo- Nesspecifické faktory Mono- Startovací inhibitorová síla (odpověď vše nebo nic) STIMULACE 1A Schematické znázornění stimulace a inhibice růstu specifickými a nespecifickými faktory. Převaha pozitivního nebo negativního signálu rozhoduje o výsledné stimulaci nebo inhibiciů závisí na metaboluické a růstové aktivitě buněk, typu buněk a dalších podmínkách - viz text. Specifické růstové účinky vnějšího prostředí buněk zahajují specifické růstové faktory (specifick0 stimul8tory) a specifické endogenní inhibitory (chalony). CSF-kolonie stimulující faktor, EGF-epidermální růstový faktor, FGF-fibroblastový růstový faktor, NGF-nervový růstový faktor, MSA-multiplikaci sti- mulující aktivita, cAMP-cyklický 3´5 -guanosinmonofosfát, BSC-1, BHK-1, MCIF, FGRF-specifické inhibitory daných buněčných linií.

- + hranice (limity): přírůstek buněk (intenzita dělení) základní stav („normalita“) před ovlivněním buněčné populace regenerativní zvýšení úrovně buněčného dělení nová úroveň rovnováhy (vysoký „obrat“ buň. populace) (vznik nádorového onemocnění) hyperplazie cytotoxické působení mitogenní stimulace + hranice (limity): přírůstek buněk (intenzita dělení) zvýšení rizika optimálního rozmezí optimum optimálního rozmezí (nekróza, apoptóza) úbytek buněk nevratného poškození - rovnovážný stav nerovnovážný stav

POČET BUNĚK V POPULACI diferenciacezánik buněk zvýšené riziko vzniku nádorových onemocnění (smrt apoptózou) tolerovaná hranice regulovaného rozmezí POČET BUNĚK V POPULACI optimální rozsah regulace „homeostázy“ na tkáňové úrovni produkce buněk (intenzita dělení - proliferace)

růstové signály receptory molekuly signálové regulátory transdukce cykliny CDKs p27 p21 p16 p15 molekuly signálové transdukce regulátory transkripce molekuly zesilovací kaskády

receptor substrates e.g. PI-3 kinase other effectors e.g. RAF-1 kinase CSF-1 c-fms G proteins (ras/GAP?) tyr tyr-P receptor substrates e.g. PI-3 kinase phospholipids phospholipases nucleus DAG mRNA other effectors e.g. RAF-1 kinase e.g.u-PA, JE, KC b actin, fibronectin R (b) hck, frg fos, jun, myc G1 cyclins ? PKC ? ? PKC DNAsynthesis ? ? H+ Fluid-phase pinocytosis Na+ Glucose Na+ K+

According to: G.Powis: TiPS; 12: 188 -194, 1991 Oncogenes Growth factor fgf-5 hst sis int-2 Growth factor Receptor bek erb B fkg fms mas ros Receptor Receptor Receptor Receptor Receptor G protein G protein G protein Transducer MEMBRANE G protein rab ral ras Receptor tyrosine kinase PLCg PLA2 Na+/H-antiport Adenylyl-cyclase Effector Arachidonate Tyrosine kinase Serine kinase abl erb B2/neu fes/fps fgr fyn kit lck 2nd messenger met ret sea src trk yes mil/raf mos pim-1 pks raf rel DG IP3 [Ca2+]i [pH]i cAMP PG TX CYTOSOL Target ? PKC PK (?) Calmodulin PKA Regulatory proteins RNA/protein synthesis Nuclear NUCLEUS fos jun myb myc ski DNA synthesis According to: G.Powis: TiPS; 12: 188 -194, 1991

Epigeneticky působící faktory, které mohou modulovat rychlost dělení, diferenciaci anebo zánik buněk Faktory, které mohou ovlivnit cytokinetiku změnami ------------------------------------------------------------------------------ 1) exprese anebo funkce molekul zapojených v přenosu signálů přímo regulujících proliferaci, diferenciaci a buněčnou smrt (apoptózou), včetně exprese protoonkogenů a nádorově-supresorových genů ---------------------------------------------------------------------------------------------- 2) signálů, které tyto funkce ovlivňují do určité míry nepřímo, jako jsou inhibice mezibuněčných spojení, ovlivnění funkce enzymů reparujících DNA, metylace DNA apod.

Modulace cytokinetiky látkami tukové povahy Lipidy a zejména jejich složky vysoce nenasycené kyseliny (PUFA), včetně jejich metabolitů eikosanoidů, patří mezi významné epigeneticky působící faktory schopné ovlivnit jak dělení a zánik normálních, ale i transformovaných buněčných populací, tak proces maligní transformace.

Hlavní mechanismy působení PUFAs 1) přímé ovlivnění aktivity transkripčních faktorů regulujících expresi genů významných z hlediska cytokinetiky 2) produkce eikosanoidů působících na přenos signálů cytokinů a imunitní systém 3) produkce reaktivních kyslíkových metabolitů vznikajících peroxidací lipidů.

Význam rovnováhy v přísunu prekursorových PUFAs a v produkci jednotlivých jejich metabolitů

KONCENTRACE MASTNÝCH KYSELIN D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984 PROLIFERACE n - 6 n - 3 n - 9 KONCENTRACE MASTNÝCH KYSELIN

KONCENTRACE MASTNÝCH KYSELIN PROLIFERACE PEROXIDACE LIPIDŮ n - 6 n - 3 n - 9 D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984 KONCENTRACE MASTNÝCH KYSELIN

KONCENTRACE MASTNÝCH KYSELIN PROLIFERACE KONCENTRACE MASTNÝCH KYSELIN n - 6 PROSTAGLANDINY D.G.Cornwell and N.Morisaki, Free Radicals in Biology. Vol.6, 1984

MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS PLA2 COOH EPOXYGENASES (P450) CYCLOOXYGENASES LIPOXYGENASES PGG2 LTA4 EPOXYACIDS, DIOLS, etc. PGH2 LTB4 LTC4 CH2 CH CO NH CH2 COOH NH COCH2CH2CHCOOH NH2 COOH LTD4 TXA2 PGI2 PGD2 PGE2 LTE4 PGE2: LTC4: TXB2 LTF4

Arachidonic acid: metabolic pathways and its possible modulations MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS INDOMETHACIN DICLOPHENAC MK - 886 NDGA ESC 5-LIPOXYGENASE CYCLOOXYGENASES 12-LIPOXYGENASE P450-MONOOXYGENASES FLAP Arachidonic acid: metabolic pathways and its possible modulations abbreviations: ETYA = 5,8,11,14 -eicosatetraynoic acid ESC = esculetin NDGA = nordihydroguaiaretic acid FLAP = 5-lipoxygenase activating protein 9-HE = 9-hydroxyellipticin HETEs = hydroxyeicosatetraenoic acids HPETEs = hydroperoxyeicosatetraenoic acids EETs = epoxyeicosatrienoic acids SKF525A = proadifen SKF525A, 9-HE ETYA PROSTAGLANDINS THROMBOXANES PROSTACYCLINS 12-HETEs 12-HPETEs LEUKOTRIENES EETs HETEs DIOLS (15-LIPOXYGENASE)

transcription factors growth factors hormones According to: A. Sellmayer et al.: Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids ; 57: 353 - 357, 1997. receptor PLA 2 + P AA PLA 2 cyclooxygenases lipoxygenases CP450 monooxygenases -ion channel activity - guanylate cyclase - adenylate cyclase - protein kinase C - protein kinase A - tyrosine kinase - MAP kinase - G-proteins eicosanoids transcription factors gene expression cell growth