Genomická a proteomická analýza fenotypu část III Kateřina Hortová Martina Černá

Vizualizace vybraných proteinů a organel na spermii a morfologie varlat u myši Všeobecný úvod (morfologie varlete a spermie; pohyb; odlišné tvary hlavičky spermií savců) CD46 protein a jeho úloha při kompetice spermií, stabilitě akrozómu a fúzi gamet Vysvětlení postupu práce a názorné předvedení izolace spermií z epididymis myši kmene C57Bl/6 Příprava imunofluorescenční detekce vybraných organel spermie Pozorování lokalizace proteinu CD46 ve spermiích

Testis size The cauda epididymis lies underneath a hairless protrusion of the scrotum.

Sperm size morphology

Sperm size / morphology Australian plain rat squirrels Breed et al., 2011

Sperm motility Single sperm: 87  24 m sec-1 Sperm agglutinate within a few minutes. Rapidly form motile groups of 10-50 sperm and then “trains” of many hundreds of sperm with sinusoidal motility. 132  21 m sec-1 (P  0.05) Sperm disaggregation in vitro correlated with onset of acrosome reaction

Riley-Vargas, R. C. et al. J. Clin. Invest. 2005; 115: 1241-1249 Acrosome reaction CD46 Riley-Vargas, R. C. et al. J. Clin. Invest. 2005; 115: 1241-1249 Froliková et al., 2011

mouse - hamster- rat vole – human – zebra finch CD46

Acrosome reaction, sperm protection CD46, CD55 and CD59 anti-human CD55 anti-rat CD59 Clift et al., 2009 Johnson et al., 2007

Accelerated AR Johnson et al., 2007

Anatomie reprodukčního traktu samce

Příprava materiálu: spermie z cauda epididymis myši sledování pohyblivosti Odstřižení cauda epididymis do 100 μl TBS (37°C), rozstřižení na 2 až 3 části, samovolné uvolňování spermii do roztoku (5-10 min) Připravit zásobu spermií: 10μl uvolněných spermii + 50μl TBS 10 μl suspenze nakápnout na podložní sklíčko přikrýt krycím sklíčkem a sledovat životnost a pohyblivost myších spermií a utváření tzv. vláčků pod světelným mikroskopem

Imunofluorescenční barvení vybraných struktur spermie myši a otisku varlete pozorování pod fluorescenčním mikroskopem Připravit otiskový preparát řezu varlete myši na podložní sklíčko (2 řady 3 otisků pod sebe) přidat 10l roztoku pro vitální barvení, přiklopit krycím sklíčkem nanést 10l zásoby myších spermií na sklíčko a přidat 10l roztoku pro vitální barvení, přiklopit krycím sklíčkem roztok pro vitální barvení: 2,5μM PNA lektin Alexa 568 - Akrozóm - (červeně) 0,2μM MitoTracker Alexa 488 - Mitochondrie - (zeleně) 5μM Hoechst 33258 - Jádro - (modře)  

Vizualizace buněčných struktur pomocí barvení Giemsa- Romanowski otiskový preparát řezu varlete myši roztěrový preparát z 5μl zásoby spermií, nechat zaschnout!!! fixovat metanolem 7 min., barvení Giemsa-Romanowski 20-30 min., opláchnout vodou, pozorovat pod světelným mikroskopem: Otisk varlete Spermatogonie, spermatocyty, spermatidy, spermie Spermie: hlavička: jádro, akrozómu bičík: střední část - mitochondriální pochva, hlavní a koncová část