VYUŽITÍ EXPLANTÁTOVÝCH KULTUR Studium základních problémů fyziologie rostlin výživa rostlin působení fyzikálních faktorů působení růstových regulátorů organogeneze, embryogeneze Množení rostlin Ozdravování rostlinného materiálu Produkce sekundárních metabolitů Biotransformace Produkce umělých semen Šlechtění rostlin

Studium základních problémů fyziologie rostlin Indukce tvorby elementů cévního systému Elementy cévního systému bloček + auxin Tvorba xylémových buněk v suspenzních buněčných kulturách (hrách, salát) požadavek : auxin, cytokinin, cukr, nutná syntéza NA, není nutné buněčné dělení !

Rediferenciace mezofylových buněk (Zinnia elegans) Studium základních problémů fyziologie rostlin Rediferenciace mezofylových buněk (Zinnia elegans) 96 hod Mezofylové buňky Xylémové buňky NAA + BA A – izolované mezofylové buňky B – kultivované buňky 96 h po izolaci C - diferencovaná xylémová buňka Signální účinek hladiny sacharidů - buněčné kultury šeříku (IAA): Lacayo et al., 2010 Lze studovat: povahu signálu, který proces spouští modulování signálu vliv na syntézu makromolekul 1% sacharózy ………………….. xylém 2% sacharózy …………………. xylém + floém 3% sacharózy………………….. xylém + floém 4% sacharózy………………….. xylém + floém Groover and Jones, 1999

Řízená morfogeneze na segmentech pomocí změn poměru auxin : cytokinin Studium základních problémů fyziologie rostlin Kultury rostlinných explantátů vhodné pro studium procesů morfogeneze Diferenciace mikrospor = unikátní nástroj studia dělení buněk + diferenciace, nezralý gametofyt  sporofyt (více než u 200 druhů zvládnuto: mikrospora  rostlina) Řízená morfogeneze na segmentech pomocí změn poměru auxin : cytokinin Studium kompetence buněk k navození organogeneze v závislosti na poloze Systém tenkých vrstev (TCL- thin cell layers) Gradient květní kapacity Ovlivnění morfogeneze působením fragmentů polysacharidů buněčné stěny inhibice auxinem stimulovaného prodlužování segmentů stonku inhibice tvorby kořenů na médiu indukujícím tvorbu kořenů (TLC) indukce vytváření květních pupenů Oligosacharidy z buněčné stěny = signální molekuly

? + Studium regulace buněčného cyklu Cytokinin působí na buněčný cyklus: v G1/S přechodu CDK A CYC D KRP + cytokinin S v G2/M přechodu M CYCA/B CDK A/B P WEE1 cytokinin ?

Regulace G2/M u kvasinky S. pombe CKI CKI CAK P CAK P P G2 cyklin CDK CDC25 G2 G2/M M

Regulace G2/M u kvasinky S. pombe CKI CAK P G2 cyklin CDK P CDC25 P CDC25 P CDC25 P CDC25 G2 G2/M M

 cytokinin  auxin  cytokinin  auxin Transformant s vneseným genem SPcdc25 z S. pombe Organogeneze de novo na stonkových segmentech Pupenů Kořenů  cytokinin  auxin  cytokinin  auxin 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA 0,1 mg/l BAP + 3 mg/l NAA kontrola transformant C k posílení tvorby pupenů k omezení tvorby kořenů exprese genu cdc25 vede

Organogeneze na médiu bez růstových regulátorů transformant Exprese genu cdc25 vede: k tvorbě pupenů de novo bez aplikace cytokininů kontrola Buněčné suspenzní kultury kontrola transformant G2/M M CYCA/B CDK A/B P „CDC 25“ cytokinin cytokinin Exprese genu cdc25 vede: změně orientace buněčného dělení a tvaru buněk

Množení rostlin Ozdravování rostlinného materiálu Produkce sekundárních metabolitů Biotransformace Produkce umělých semen Šlechtění rostlin

Množení rostlin Ozdravování rostlinného materiálu Produkce sekundárních metabolitů Biotransformace Produkce umělých semen Šlechtění rostlin

Množení rostlin Ozdravování rostlinného materiálu Produkce sekundárních metabolitů Biotransformace Produkce umělých semen Šlechtění rostlin

Množení rostlin v podmínkách in vitro Množení rostlin : 1) generativní 2) vegetativní in vivo Generativní množení Vegetativní množení malé nasazení semen rychlá ztráta klíčivosti dlouhý generativní cyklus dormance semen genetická heterogenita pomalé množení často obtížné u řady druhů nemožné infekce Nevýhody Výhody semena bez patogenů snadné skladování, transport, manipulace rychlý cyklus množení genetická uniformita Výhody Nevýhody velký počet jedinců v krátkém čase genetická uniformita u druhů, kde in vivo není možné bez patogenů nezávislost na vegetačním období možnost množení: haploidi, sterilní, mutanti, aneuploidi, zachování specifické genové kombinace slabá genetická stabilita problémy s přenosem do ex vitro aseptická kultivace, pracnost postupná ztráta regenerační kapacity Vegetativní množení in vitro Pečlivým výběrem podmínek a postupů lze minimalizovat

Vegetativní množení in vitro Množení rostlin v podmínkách in vitro Vegetativní množení in vitro Zahrnuje: meristemové kultury (kultury vzrostných vrcholů) úžlabní odnožování somatickou embryogenezi regeneraci odventivních orgánů na řízcích regeneraci z buněčných kultur tvorbu adventivních orgánů v tkáňových kulturách regeneraci z protoplastových kultur George, 1993

Vegetativní množení in vitro Množení rostlin v podmínkách in vitro Vegetativní množení in vitro Zahrnuje: meristemové kultury (kultury vzrostných vrcholů) úžlabní odnožování somatickou embryogenezi regeneraci odventivních orgánů na řízcích regeneraci z buněčných kultur tvorbu adventivních orgánů v tkáňových kulturách regeneraci z protoplastových kultur George, 1993

Vegetativní množení in vitro Množení rostlin v podmínkách in vitro Vegetativní množení in vitro Zahrnuje: meristemové kultury (kultury vzrostných vrcholů) úžlabní odnožování somatickou embryogenezi regeneraci odventivních orgánů na řízcích regeneraci z buněčných kultur tvorbu adventivních orgánů v tkáňových kulturách regeneraci z protoplastových kultur George, 1993

Vegetativní množení in vitro Množení rostlin v podmínkách in vitro Vegetativní množení in vitro Zahrnuje: meristemové kultury (kultury vzrostných vrcholů) úžlabní odnožování somatickou embryogenezi regeneraci odventivních orgánů na řízcích regeneraci z buněčných kultur tvorbu adventivních orgánů v tkáňových kulturách regeneraci z protoplastových kultur George, 1993

Vegetativní množení in vitro Množení rostlin v podmínkách in vitro Vegetativní množení in vitro Zahrnuje: meristemové kultury (kultury vzrostných vrcholů) úžlabní odnožování somatickou embryogenezi regeneraci odventivních orgánů na řízcích regeneraci z buněčných kultur tvorbu adventivních orgánů v tkáňových kulturách regeneraci z protoplastových kultur George, 1993

Vegetativní množení in vitro Množení rostlin v podmínkách in vitro Vegetativní množení in vitro Zahrnuje: meristemové kultury (kultury vzrostných vrcholů) úžlabní odnožování somatickou embryogenezi regeneraci odventivních orgánů na řízcích regeneraci z buněčných kultur tvorbu adventivních orgánů v tkáňových kulturách regeneraci z protoplastových kultur George, 1993

Vegetativní množení in vitro Množení rostlin v podmínkách in vitro Vegetativní množení in vitro Zahrnuje: meristemové kultury (kultury vzrostných vrcholů) úžlabní odnožování somatickou embryogenezi regeneraci odventivních orgánů na řízcích regeneraci z buněčných kultur tvorbu adventivních orgánů v tkáňových kulturách regeneraci z protoplastových kultur George, 1993

Množení rostlin Ozdravování rostlinného materiálu Produkce sekundárních metabolitů Biotransformace Produkce umělých semen Šlechtění rostlin

Množení rostlin Ozdravování rostlinného materiálu Produkce sekundárních metabolitů Biotransformace Produkce umělých semen Šlechtění rostlin

Ozdravování rostlin Většina rostlin – systematická infekce, rostlina nemusí zahynout --- omezení růstu  snížení výnosu, snížení kvality plodů. --- infekce bakteriemi, houbami, viry Odstranění patogenů důležité pro: zvýšení výnosu, kvalitu produktů možnost pohybu rostlinného materiálu přes hranice semeno viruprostá rostlina, ale sexuálně množené rostliny -- genetická variabilita někdy není napadena celá populace  výběr zdravých jedinců  vegetativní množení často napadena celá populace  problém č. 1 : získat zdravou rostlinu  vegetativní množení Nerovnoměrné rozložení patogena Apikální meristémy často zcela viruprosté či s nízkou koncentrací Koncentrace obvykle vzrůstá se vzdáleností od apexu Důvody nerovnoměrného rozšíření virů v rostlině: pohyb virů po rostlině cévním systémem vysoká metabolická aktivita apexu nedovoluje replikaci virů vysoká hladina endogenních auxinů v apexu inhibuje multiplikaci virů

??!! Ozdravování rostlin Termoterapie - eliminace teplem °C Zóna růstu Zóna terapie ??!!  poškození patogena zabití patogena °C Zóna růstu Zóna terapie  Poškození patogena zabití patogena Nevýhody termoterapie Necitlivost virů k vyšším teplotám X citlivost rostlin Způsoby aplikace horkou vodou – dormantní pupeny horkým vzduchem - aktivně rostoucí výhony teploty 35-40°C, trvání několik min až několik měsíců, pomalé zvyšování teploty, střídání nízkých a vysokých teplot

Ozdravení pomocí kultivace explantátů Ozdravování rostlin Ozdravení pomocí kultivace explantátů Kultivace vzrostných vrcholů (apikální meristem + 1-3 listová primordia)  větší šance na přežití Kultivace meristemových kultur  větší šance na získání bezvirózní rostliny, Kryoprezervace vzrostných vrcholů  precizní „výběr“ meristematických buněk Ne vždy je meristem viruprostý  kombinace metod termoterapie a kultivace apikálních meristemů působit na mateřskou rostlinu působit na explantát postup opakovat Chemoterapie Chemoterapie celých rostlin často nevede k cíli … ošetření explantátových kultur in vitro lepší výsledky Přítomnost R.R. snižuje výskyt virů Eliminace virů kultivací tkáňových kultur Ne všechny buňky tkáňové kultury nesou virus replikace virů nestačí držet krok s dělením buněk některé buňky jsou rezistentní (mutace, rezistentní buňky již v mateřské rostlině)

Testování úspěšnosti eliminace Ozdravování rostlin Testování úspěšnosti eliminace sledování příznaků choroby indikátorové rostliny sérologické testy elektronmikroskopické sledování Uchovávání bezvirózních rostlin Nebezpečí nové infekce - množení ve sklenících nebo v oblastech s  výskytem patogena Zvýšená citlivost, křížová ochrana, řízená reinfekce Viry X X Ozdravení Cílená infekce X X Rostlinná buňka Materiál pro studium interakce virus-rostlina Význam eliminace virů Zlepšení výnosu a kvality potravin Splnění požadavku pro vývoz plodin

    Př.: Bezvirózní rostliny- česnek ozdravení in vitro meristemové kultury 30-40% přežití , 65 % bezvirózní  Soliman et al., 2011 Př.: Bezvirózní rostliny- česnek Riziko : vegetativní množení Ozdravování: chemoterapie 205 µM Ribavirin  100% přežití , 20-30% bezvirózní termoterapie 60-70 % přeživších – bezvirózní 20-30 % přežití  32°C - 1 týden + 36°C dva týdny + 38°C tři týdny Po 4 vegetačních obdobích o 20 % vyšší výnos  Perotto et al., 2010 Ramírez-Malagónet al., 2006