OSMOTICKÁ FRAGILITA ERYTROCYTŮ

TEST OSMOTICKÉ FRAGILITY DEFINICE - test pomocí kterého se měří odolnost erytrocytů, vystavených hypotonickým roztokům, vůči hemolýze Erytrocyty jsou vystaveny sérii roztoků chloridu sodného (NaCl), přičemž se zvětšuje ředění solného roztoku Čím dříve dojde k popraskání erytrocytů, tím je větší jejich osmotická fragilita

Isotonický (fyziologický) roztok – 0.9 % NaCl Erytrocyty popraskají v hypotonickém (< 0.9 % NaCl) a scvrkají v hypertonickém roztoku (> 0.9 % NaCl) V hypotonickém prostředí dochází ke prasknutí membrány a vychází hemoglobin (Hb) z buněk Měřením koncentrace Hb, lze vypočítat procento hemolýzy při různých koncentracích NaCl

NORMALNÍ ROZMEZÍ - začátek hemolýzy při: 0.45-0.5 % NaCl - hemolýza dokončená: 0.3-0.33 % NaCl FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ OSMOTICKOU FRAGILITU - propustnost buněčné membrány - poměr buněčného povrchu a objemu

ZVÝŠENÁ OSMOTICKÁ FRAGILITA - hereditární sférocytóza - získaná sférocytóza Hereditární sférocytóza je nemoc charakterizovaná vadnou membránou erytrocytů a sníženým poměrem povrchu a objemu V krevním nátěru jsou vidět charakteristické kulaté buňky (sférocyty), které jsou křehčí než normální erytrocyty a praskají už v méně hypotonickém roztoku

V hypotonickém roztoku voda vchází do erytrocytů Proto, normální erytrocyty s bikonkávní formou v takovém prostředí bobtnají a rozšiřuje se jejich objem Naopak sférocyty nemohou nasát moc extracelulární tekutiny a praskají snadno www.marvistavet.com

SNÍŽENÁ OSMOTICKÁ FRAGILITA - talasémie - srpkovitá anémie - anémie z nedostatku železa

PRACOVNÍ POSTUP Použijeme lidskou plnou krev, která byla vypláchnuta fyziologickým roztokem a neobsahuje již plasmu, ale pouze erytrocyty. Označíme si 5 eppendorfek čísly 1-5 a do každé zkumavky napipetujeme 1 ml odpovídajícího připraveného roztoku: roztok 1 - neředěný fyziologický roztok roztok 2 - fyziologický roztok ředěný vodou v poměru 3:1 roztok 3 - fyziologický roztok ředěný vodou v poměru 2:1 roztok 4 - fyziologický roztok ředěný vodou v poměru 1:1 roztok 5 - fyziologický roztok ředěný vodou v poměru 1:5, obsahující NH44Cl (NH4Cl navodí zkrat zbývajících membránových pump)

Do zkumavek 1-5 napipetujeme po 50 μl suspenze erytrocytů, jemně promícháme a necháme 10 min. stát. Potom zkumavky zcentrifugujeme (3 000 x g, 3 min.) a opatrně odebereme supernatant na stanovení hemoglobinu. Připravíme 5 skleněných zkumavek 1-5 s 2 ml Drabkinova činidla. Do každé zkumavky přidáme 50 μl supernatantu. Změříme absorbanci při vlnové délce 400 nm proti slepému vzorku (Drabkinovo činidlo)

Vzhledem k tomu, že se nejedná o čerstvou krev, zjistíme částečnou hemolýzu i ve zkumavce č. 1. Množství hemoglobinu zde stanovené budeme považovat za kontrolu a odečteme je od hodnot naměřených ve zkumavkách 2 - 5. Množství hemoglobinu změřené ve zkumavce č. 5 je maximálně možné a vyjádříme je jako 100% hemolýzy. Na tomto základě potom vypočítáme % hemolýzy ve zkumavkách 2 - 4. Do připraveného grafu (k dispozici v laboratoři) zaneste naměřené hodnoty absorbance a odečtěte z něho koncentraci hemoglobinu (mg/l).