Excitabilní membrány aneb Všechno co jste chtěli vědět o přenosu nervového vzruchu a neodvážili se nikdy zeptat

Hey baby! Fancy conjugating? Excitabilita (vzrušivost) je jednou ze základních definičních vlastností živých organismů = schopnost reagovat na okolní prostředí Yum!!! Urggh!! Birds do it, bees do it, even educated fleas do it Men!!! Hey baby! Fancy conjugating?

Will you PLEASE stop dividing! Mnohobuněčné organismy mají VELKÉ komunikační problémy: Oi! We need some glucose! Hey You – divide now!!! ? Will you PLEASE stop dividing! Come in #7, your time is up!

‘Babylonská věž’ - Albrecht Dürer (1471-1528) V podstatě je mnohobuněčný organismus tak trochu … ‘Babylonská věž’ - Albrecht Dürer (1471-1528)

a) Rozlišení relevantních a irelevantních signálů Problémy signalizace Buňky jsou vystaveny obrovskému množství signálů přicházejících z jiných buněk nebo z okolního prostředí a) Rozlišení relevantních a irelevantních signálů b) Detekce signálů v nízké intenzitě (koncentraci) c) Překlad signálů do vnitrobuněčného jazyka

Řešení: a) Rozlišení relevantních a irelevantních signálů * vysoce specifické receptory b) Detekce signálů v nízké intenzitě (koncentraci) * receptory s vysokou afinitou c) Překlad signálů do vnitrobuněčného jazyka * aktivace signálních drah založených na několika společných principech

Buněčné odpovědi na signály Změna metabolismu např. metabolismus glykogenu a insulin Změna genové exprese – např. syntéza imunoglobulinů v odpovědi na cytokininy Růst a dělení (mitogenesis) – odpověď na růstové faktory Programovaná buněčná smrt vyvolaná apoptickými faktory Vzruch (excitace) např. šíření nervového vzruchu vyvolané neurotransmitery

Typy vzrušivých buněk Nervové buňky myelizovaná nervová vlákna (rychlý přenos) nemyelizovaná nervová vlákna (pomalý přenos) Svalové buňky Příčně-pruhovaný sval kostní svaly (vědomé ovládání) srdeční sval Hladký sval (nevědomé ovládání)

Morfologie neuronů

Morfologie neuronů

Iontová podstata membránové vzrušivosti elektrický membránový potenciál mají excitovatelné i neexcitovatelné buňky membránový potenciál je vyvolán asymetrickou distribucí Na+ a K+ iontů v klidovém stavu ( u nevzrušivých buněk vždy) je vnitřek buňky záporně nabitý vzhledem k vnějšku elektrický vzruch („akční potenciál“) = krátké převrácení orientace membránového potenciálu klidový i akční potenciál lze popsat jako difúzní potenciály

Difúzní potenciál (1) no potential - + - +

Difúzní potenciál (2) still no potential - + - + + -

Difúzní potenciál (3) negative positive - + - + - + - + - + - + - + -

Difúzní potenciál (3) Hnací síla 1: Koncentrační gradient - - - - + + - - + + Hnací síla 2: Nerovnoměrné rozdělení náboje

Nerstova rovnice pro difúzní potenciál R  T z  F Cout Cin  ln E: R: T: F: z: Cin,Cout difúzní potenciál plynová konstanta (8.31 J  K-1mol-1) abs. teplota (K) Faradayova konstanta (96500 Coulomb/mole) náboj iontu (1 pro K+ a Na+, 2 pro Ca2+, -1 pro Cl-) konc. iontu vně a uvnitř buňky

Pro více difundujících iontů: Uvnitř Vně Rovnovážný potenciál Na+ 15 mM 150 mM +60 mV K+ 150 mM 6 mM -90 mV Klidový membránový potenciál: -70 mV

Pro více difundujících iontů (2): Nernstova rovnice: E = R  T z  F Cout Cin  ln Goldmanova rovnice (specialní případ pro Na+ and K+): E = R  T F PK  CK,out + PNa  CNa,out  ln PK  CK,in + PNa  CNa,in Discuss some special cases, and the variations of permeability by opening and closing channels Mention that the permeabilities do not have to be large in absolute terms P = Permeabilita – faktor ovlivněný stavem příslušných kanálů

Klidový potenciál je v podstatě potenciálem K+ iontů negative positive + - K+ Na+ - + K+

Na+-kanály se otvírají při obrácení klidového potenciálu negative positive + Na+ + negative positive

Napětím-ovládané Na+-kanály šíří akční potenciál negative positive - - - - Na+ Na+ + outside + + inside Na+ sodium and potassium are the mainstay of AP spread on nerve and skeletal muscle cells heart muscle and pacemaker is different K+ negative K+ K+ K+ - - - - positive spreading action potential

Elektrická depolarizace nervových vláken může vyvolat akční potenciál - 55 mV - 70 mV - 85 mV Prahový podnět Vnější stimuly různé amplitudy time (ms)

Goldmanova rovnice a akční potenciál ENa (+60 mV) EK (-90 mV) Resting potential: PK > PNa Depolarizace: Na+ kanály otevřeny (PNa > PK) Hyperpolarizace: Na+ kanály uzavřeny (PK >> PNa) Repolarizace: K+ kanály se otvírají Na+ kanály se zavírají

Otázky: Jak je akční potenciál ukončen ? Jak je akční potenciál vyvolán ?

Ukončení akčního potenciálu (1) Na+ i K+ kanály jsou řízeny napětím: Resulting membrane potential Na+ influx In addition to the constitutively open potassium channels that are responsible for the resting potential, there are more slowly responding voltage-gated potassium channels that oppose the action of the sodium channels: K+ efflux duration: a few milliseconds

Ukončení akčního potenciálu (2) Na+ kanály cyklují mezi 3 odlišitelnými funkčními stavy: Uzavřeno Otevřeno Inaktivace Depolarizace Spontánní inaktivace Pomalá reaktivace po membránové repolarizaci In the inactivated state, the sodium channel is functionally closed and refractory to opening despite continued membrane depolarization.

Struktura K+-kanálů cesta pro ionty K+ Ovládající sensor Here, you can comment on the randomness of the individual events – all traces shown so far are averages Inaktivační peptid (N-konec)

stav: UZAVŘENO + - - - + + +

stav: OTEVŘENO + - - - + + +

stav: INAKTIVACE + - - - + + +

Jak je udržována asymetrická distribuce iontů na membráně ATP ADP + Pi 3 Na+ 3 Na+ Ca++ Na+ Glucose Cl- K+ K+ Na+

Vyvolání akčního potenciálu spontánní rytmická depolarizace . příklad: specializované buňky srdce a hladkých svalů elektrické spojení sousedních buněk mezibuněčnými spoji příklad: srdeční sval, hladký sval synaptický přenos příklad: vedení signálu nerv-nerv, nerv-sval

Synaptický vzruch Presynaptický potenciál Presynaptické zakončení Na+ EK ENa Postsynaptická zakončení K+ Na+ synaptická štěrbina

Synaptický vzruch (2) - + - + - otevření kanálů řízených vazbou ligandu – neurotransmiteru a vyvolání akčního potenciálu na post-synaptické membráně

Iniciace akčního potenciálu v rytmických buňkách srdce Are these actually two different channels, or is it one channel that has some leakiness in below the threshold? - spontánní diastolická repolarizace = zahájení šíření akčního potenciálů po kardiomyocytech převodní soustavy srdeční („pacemakerové buňky“)

Iniciace akčního potenciálu v rytmických buňkách srdce (zůstává nadbytek negativního náboje) Ca2+ Ca2+ K+ + + Are these actually two different channels, or is it one channel that has some leakiness in below the threshold? Ca2+ K+ K+ - dva druhy Ca2+ kanálů vyvolávají spontánní depolarizaci

Iniciace akčního potenciálu v rytmických buňkách srdce 0 mV Ca2+L -40 mV Ca2+T Note the relatively high resting potential – indicating a low K+ permeability -60 mV pomalý spontánní prepotenciál

Buněčná excitace elektrickým propojením přes gap junctions - - - - - + + + + - - - - - + + + + Gap junction

Přenos akčního potenciálu v neuronové síti

Vnitro- a vněbuněčné koncentrace iontů Uvnitř Vně Rovnovážný potenciál Na+ 15 mM 150 mM +60 mV K+ 150 mM 6 mM -90 mV Cl- 9 mM 125 mM -70 mV Ca2+ 100 nM 1.3 mM +130 mV Otevření Na+ kanálů zvýší potenciál (depolarizace) Otevření K+ nebo Cl- kanálů sníží potenciál (repolarizace nebo hyperpolarizace)

Na+ a Cl- v excitačních a inhibičních synapsích Excitace Inhibice Na+ Cl- Explain summation positive + negative

Bioenergetika mozkové činnosti Mozek * 2 % tělesné hmotnosti * 20% spotřeby O2 (v tělesném klidu) hlavním zdroj energie = glukosa „Bioimaging“ – experimentální zobrazení mozkové aktivity dnes používána PET + moderní metody fMRI – funkční zobrazení magnetickou resonancí * bez radioaktivních látek jako PET (19F-fluorodeoxyglukosa) * využívá vlivu paramagnetismu deoxyHb na relaxační časy protonů vody (metoda BOLD = blood O2 level dependent) 1H-MRS: identifikace a koncentrace metabolitů (GABA, Glu, ..) 13C-MRS: inkorporace 13C-značených substrátů ~ metabolické toky

PET bioimaging

fMRI bioimaging - aktivita mozkových neuronů při motorickém, visuálním a kognitivním procesu

Neurofyziologická interpretace dat x dřívější psychologické interpretace - největší podíl energie 1) aktivace neuronů 2) recyklace neurotransmiterů VÝSLEDKY = nový pohled na funkci mozku prokázána existence automatického regulačního systému spřažení dodávky krve (glukosa, O2) a chemických reakcí s funkcí neuronů neurotransmise glutamátem přímo spřažena s bioenergetikou neuronu klidová spotřeba = cca 75 % maximální spotřeby mozku! - úloha astrocytů – tvorba Arg z citrulinu – substrát pro nNOS NO jako vasodilatační faktor – zvýšení průtoku krve

Význam astrocytů pro neuronální metabolismus * cyklování Glu-Gln přes astrocyty = ochrana neuronu před excitoxicitou Glu * v nestimulovaném stavu - 80% energie na recyklaci Glu GABAergní neurony pouze 5% z celkové energie (malý pool Glu) vztah spotřeby energie – frekvence vzruchů a recyklace neurotransmiteru: CMRO2 ~  ~ Vcyc

Cyklus Glu-Gln v astrocytech a neuronech * pumpování uvolněného Glu ze synaptické šterbiny do astrocytu

Bioenergetika mozkové činnosti experimentálně zjištěná stechiometrie – glukosa/Glu 1:1

Bioenergetika mozkové činnosti 1 molekula glukosy = glykolýzou 2 molekuly ATP potřebné pro syntézu a transport glutamátu

Podíl neoxidativního metabolismu v mozku Mozek typicky „aerobní orgán“, ale: * stav nízké aktivity = dostatečné reservy ATP a fosfokreatinu pro recyklaci Glu * stav vysoké aktivity = potřeba dodatečný rychlý (řádově ms) zdroj energie analogie anaerobního metabolismu při první fázi intenzivní svalové práce  zvýšená produkce laktátu – výměna z krve astrocyty – bohaté na glykolytické enzymy neurony – vysoký počet mitochondrií důležitost monokarboxylátových přenašečů (pravděpodobně i pro ketolátky – aceton)

Excitoxicita glutamátu Obranné mechanismy neuronů při zvýšené excitaci: a) zvýšená konc. Ca2+- akumulace v MTCH = zvýšení oxid. metab. b) otevření K+-kanálů a hyperpolarizace buňky c) odbourání ATP na AMP, adenosin – zpětná inhibice uvolňování Glu d) aktivace antioxidačních enzymů Praktický příklad: dlouhotrvající stres nebo deprese = vysoká hladina glukokortikoidů = inhibice obranných mechanismů a), b), c) = atrofie hypokampu – neurotoxicita pro Glu neurony

Vztah mezi vědomím a energetikou mozku Studia na populacích neuronů – „hlasování“ = součet potenciálů při vytváření vzruchu na jiném neuronu - „titrace“ = zvyšující se dávka anestetik 1) při bezvědomí max. snížení frekvence zážehů vzruchů na 50% odpovídající 50 % snížení spotřeby energie odpovídá „unresponsiveness point“ = zmizí „vědomí“ 2) senzorické vzruchy při vědomí pouze modulují již existující vysokou aktivitu mozku (oscilace neuronů) x protiklad „počítačového modelu“ mozku 3) synchronizované zážehy talamo-korových spojení vytváří základ subjektivního sebeuvědomění

Další hypotetické funkce astrocytů * astrocyty jako přenašeče glukosy z  kapilár do neuronů při stimulaci lokální konc. glukosy kolem akt. synapsí vzrůstá! * astrocyty jako zásoba ekvivalentů glukosy glykogenolýza – aktivace cAMP při neuroadrenergní stimulaci * astrocyty jako součást sítě přenosu vzruchů každý astrocyt – kontakt s cca 30.000-40.000 synapsí propojení buněk přes gap junctions na vzdálenost cca mm přenos vlny Ca2+ polarizace * komunikace astrocytů a neuronů - vzniku neurodegenerativních poruch

ATP -purinergní přenos signálu Mechanismus účinku: = vazba na P2Y-receptory – propojení na G-proteiny Možné mechanismy uvolnění ATP neurotransmiter - funkce v CNS, periferálním a enterickém nervstvu b) vyplavení z poraněných buněk – kožní sensory na poškození, periferální záněty c) ne-neurální zdroje – např. karotidová tělíska – současné uvolnění ATP a acetycholinu jako signál hypoxie

ATP jako neurotransmiter v trávicím systému Řízení reflexů v trávicím systému: * mechanické podněty ve střevech – vyloučení ATP z buněk epitelu např. inhibitory P2Y receptorů v močovém měchýři = inhibice vyprazdňovacího reflexu * ATP vyvolává akční potenciál na myoenterických sensorových neuronech * účinek ATP je ukončen extracelulární ectonukleotidasou

Model purinergní neurotransmise

Model purinergní neurotransmise (2)

Vápník a membránové potenciály udržování vysoké krevní hladiny Ca2+ umožňuje rychlé zvýšení intracelulárního Ca2+ Ca2+ jako přenašeč signálu – nutná přesná buněčná regulace Ca2+ (mM) PM pumps ICa Ca2+ (50 nM) leak ER serca Ca2+-B (buffering) Mitochondria

Ca2+ ve svalu SR - specializovaná organela

Ca2+ ve fototransdukci Hyperpolarizace membrány optického neuronu (uzavření kanálů pro Na+ a otevření kanálů pro K+) = při podráždění se snižuje množství uvolněného neurotransmiteru)

Ca2+ ve fototransdukci

Ca2+ v receptorech chuti

Hlavní mechanismy transportu Ca 2+ Nezávislé na membránovém potenciálu. Oscilace recyklací Ca 2+ do a z vnitřních skladů (ER a mitochondria) Pohyb dovnitř přes napětím řízené kanály. Záleží na fluktuaci membránového potenciálu. Ryanodinové receptory IP3 receptory Elektricky vzrušivé buňky Svalové buňky a neurony Elektricky nevzrušivé buňky. Hladké svaly

„Vápníková excitabilita“ 2 typy receptorů - IPR a RyR oba typy uvolňují vápník v odpovědi na Ca2+ signál uvolnění dalšího množství Ca2+ (excitabilní odpověd) přesný mechanismus neznám x modely IPR – chování podobné Na+ kanálu: v odpovědi na zvýšené [Ca2+] se nejprve rychle aktivuje a poté pomalu deaktivuje – důsledkem je krátkodobé vyplavení velkého množství vápníku

IP3 Receptor pathway

Ryanodine Receptor pathway

Příště …