BENG - membrány Biomembrány 4.ročník biochemie

BENG-membrány Membrány a buňka Obecné vlastnosti a struktura

Buněčné membrány Rostlinná buňka (lilie) Živočišná buňka (jaterní) BENG-membrány Buněčné membrány Rostlinná buňka (lilie) Živočišná buňka (jaterní)

BENG-membrány Membrány - struktura

BENG-membrány Membrána - model

Membrány přeměnující energii BENG-membrány Membrány přeměnující energii * na těchto membránách je syntetizován největší podíl ATP (něco málo i v cytoplazmě) * obsahují 2 odlišné typy protonových pump 1) PRIMÁRNÍ - velmi různorodé podle zdroje energie 2) SEKUNDÁRNÍ - vysoce konzervované - oba systémy jsou velmi těsně spřaženy TYPY: * plasmatická membrána prokaryot * vnitřní membrána mitochondrií * membrány thylakoidů v chloroplastech

BENG-membrány Přehled membrán Přehled membrán (P = positive, strana kam jsou protony čerpány)

Chemiosmotická teorie - základ BENG-membrány Chemiosmotická teorie - základ „Hypotetický“ thylakoid - chemiosmotické spřažení přenos protonů a syntézy/hydrolýzy ATP Přídavek ATP = čerpání protonů Ustavení rovnováhy Odstranění ATP = tok protonů ven a syntéza ATP (užitečná práce) pokud pracuje prim.pumpa 2) pokud spotřeba ATP a přísun ADP/P Dynamická rovnováha (reverzibilita reakcí a toků) systém nekoná užitečnou práci

Tok elektronů a protonů BENG-membrány Tok elektronů a protonů Tok protonů -analogie elektrických obvodů s tokem e- p  V JH+  I CMH+  vodivost „ATPasa - spotřebič protonového proudu“

Vlastnosti membrán Důležité vlastnosti membrán: BENG-membrány Vlastnosti membrán Důležité vlastnosti membrán: a) resistence průchodu protonů („protonový odpor“) „protonofory“ (uncouplers, rozpojovače) - pozorovány dávno před Mitchellem - způsobují „zkrat“ v obvodu protonů b) transportní systémy pro metabolity * transport negativně nabitých látek látky do MTCH * současný přenos s H+ nebo OH-

Mitochondrie 1 Mitochondriální a submitochondriální částice BENG-membrány Mitochondrie 1 Mitochondriální a submitochondriální částice Klasický „obraz“ – zmrazené preparáty a TEM

a submitochondriální částice BENG-membrány Mitochondrie 1 Mitochondriální a submitochondriální částice - dynamicky se měnící tvar v různých typek buněk podle jejich aktivity - těsný kontakt s ER (intenzivní výměna Ca2+ iontů ) - malý kontakt mezi kristami a mezimembránovým prostorem (měření HREM a 3D modely PT)

Mitochondrie - jak je neznáme ... BENG-membrány Mitochondrie - jak je neznáme ... Pohled shora: Lamelární topologie 4 segmentovaných krist mezi vnější a vnitřní membránou Boční pohled: Otvory spojů krist (černě) spojují mezimembránový prostor s intrakristálním prostorem Elektronová tomografie mitochondrií (National Center for Microscopy and Imaging Research at UCSD) http://www.sci.sdsu.edu/TFrey/MitoMovie.htm

Mitochondrie - jak je neznáme ... BENG-membrány Mitochondrie - jak je neznáme ... 3D model MTCH (krysí játra) - interkonektivita krist - tubulární tvar Normální Myopatie Nové otázky: - gradienty metabolitů (ADP) v kristách ? - izolované kulovité kristy ? vztah k patologickým vztahům ? propojení MTCH / EPR

Mitochondrie 2 Mitochondrie v různých typech buněk: NEURONY BENG-membrány Mitochondrie 2 Mitochondrie v různých typech buněk: NEURONY - diskrétní filamenta v cytoplazmě - mobilní podél axonů a dendritů difúzní koeficient ~0.8 µm2/s (2-4x pomaleji než v roztoku) SVALOVĚ BUŇKY - velké množství krist

BENG-membrány Mitochondrie - sval Mitochondrie svalových buněk

Mitochondriální membrány BENG-membrány - vnější nespecifické póry pro metabolity < 10kDa „poriny“ (VDAC, voltage dependent anion channels) x není membránový potenciál - vnitřní „energy transducing“ - dýchací řetězec a ATPasa speciální transportní mechanismus pro proteiny značení orientace membrány: N-side (negative): do matrix P-side (positive): do mezimembránového prostoru POZOR: u submitochondriálních preparátů přípravených sonikací dochází k inverzi!!

Respirující baktérie Gram-negativní bakterie (velikost cca jako MTCH) BENG-membrány Respirující baktérie Gram-negativní bakterie (velikost cca jako MTCH) * membrána oddělena od peptidoglykanové stěny periplasmem Gram-pozitivní bakterie * membrána přiléhá přímo k vnější buněčné stěně ROZDÍLY: - mnoho látek neprochází vnější membránou Gram-negativních - ADP/ATP a NAD+/NADH neprochází cytoplasmatickou membránou - obtížné „vyhladovění“ - odstranění vnitřních substrátů - studium transportu metabolitů komplikováno jejich možnou přeměnou

Membrána Gram-negativní baktérie BENG-membrány Membrána Gram-negativní baktérie

BENG-membrány Chloroplasty

Chloroplasty - thylakoid BENG-membrány Chloroplasty - thylakoid velikost: 4-10 m průměr, 1-2 m tlouštka

BENG-membrány Membrána thylakoidů - lumen tvoří oddělený prostor od mezimembránového prostoru - ATP a NADPH používány ve stroma k fixaci CO2 - „broken chloroplast“ - bez vnější membrány a stromatu

Purpurová baktérie Rhodobacter BENG-membrány Purpurová baktérie Rhodobacter Nejstudovanější skupina: a) tvorba „chromatoforů“ b) snadné studium * malá velikost * opticky jasné suspenze c) snadná izolace reakčních center

Obecné vlastnosti Lipidická dvojvrstva membrán: BENG-membrány Lipidická dvojvrstva membrán: nepropustná pro většinu iontů včetně H+ vysoký odpor (potenciál 200mV = elektrické pole 3.105 V/cm-1) B) propustná pro řadu nenabitých látek 02, CO2, NH3, octanový anion (využito pro studium pH gradientů) C) polární molekuly vody: aquaporiny = vodupropustné kanály (Peter Agre – Nobelova cena 2003)

BENG-membrány Aquaporiny

BENG-membrány Transport iontů - Transport iontů integrální součást chemi-osmotické teorie Membrány přeměňující energii mají obecně shodné vlastnosti jako všechny ostatní buněčné membrány Pro transport musí existovat hnací síla Typy transportu: Difúze lipidickou vrstvou x přenašeč (ionofor, protein) Pasivní přenos x energetické spřažení (aktivní transport) Jediný ion x spřažený přenos 2 a více iontů Dochází k výslednému přenosu náboje ?

BENG-membrány Transport iontů 1

BENG-membrány Transport iontů 2

Specifika energetických membrán 1 BENG-membrány Ad 1) difúze x přenašeč Proteinové složení Vnitřní MTCH : 50% plochy integrální proteiny!! 25% periferální proteiny, 25% lipidy - přenašeče v MTCH krysích játer x nejsou v MTCH srdce Lipidové složení * Vnitřní MTCH: 20% kardiolipin (fosfolipid) - vysoká elektrická izolace, struktura, náboj x Barthův syndrom * Thylakoid: 16% kardiolipin 40% galaktolipidy 40% fotopigmenty kardiolipin

Specifika energetických membrán 2 BENG-membrány Ad 2) pasivní x spřažený transport Pro stejný iont existují různé mechanismy ! * sarkoplasmatické retikulum – iontová pumpa Ca2+ - ATPasa * vnitřní MTCH membrána – uniport pro Ca2+/Na+ poháněný  „Aktivní“ transport – pouze přenos katalyzovaný proteiny může být přímo spřažen s metabolismem

Specifika energetických membrán 3 BENG-membrány Ad 3) uniport, symport a antiport Příklady: Bakteriální membrána: symport H+/metabolity do buňky Lipidické dvojvrstvy: antiport K+/H+ s nigericinem Obtížné experimentální rozlišení H+/OH- např. fosfátový přenašeč je P-/OH- antiport nebo P-/H+ symport ? Jeden ion se může účastnit více blízce spjatých drah: Na+ uniport (kanály aktivované membránovým potenciálem) Na + symport (ko-transport s glukosou) Na + antiport (přenašeč 3Na+/Ca2+)

Specifika energetických membrán 4 BENG-membrány Ad 3) elektroneutrální x přenos náboje Celkově elektroneutrální přenos x na molekulární úrovni dochází k neustálému přenosu náboje Jedna dráha přenosu se může podle podmínek chovat jako: elektrogenní = vytvářející elektrický potenciál na membráně elektroforetická = přenos iontů na úkor elektrického potenciálu

BENG-membrány Ionofory Funkce ionoforu = snížení aktivační energie potřebné pro zanoření polární látky do nepolární lipidické vrstvy a) Přírodní – antibiotika b) Syntetické – studium vlastností membrán a transportu iontů látky MW cca 500-2000 Da, hydrofobní povrch a hydrofilní jádro Mechanismus: mobilní přenašeče: rychlost cca 1000 iontů/s-1, vysoká specifita pro ionty, ovlivněny fluiditou membrány tvorba kanálů: nízká diskriminace mezi ionty x vysoká rychlost cca 107 iontů/s-1

Přenos náboje bez přenosu H+ BENG-membrány Přenos náboje bez přenosu H+ Valinomycin (Streptomyces) * (L-Val-D-hiVA-D-Val-D-Lac)3 * uniport Cs+, Rb+, K+, NH4+ * přenos Na+ - 104 x menší než K+ * volný Val i nabitý komplex prochází membránou * katalytická účinnost 10-9 M Gramicidine * přechodná tvorbu dimerů - kanály * nízká selektivita pro jednomocné kationty * rychlost limitována pouze difúzí (cca 107 iontů/s-1) HCO-L-Val-Gly-L-Ala-D-Leu-L-Ala-D-Val-L-Val-D-Val-L-Trp-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-D-Leu-L-Trp-NHCH2CH2OH

Valinomycin a gramicidin – přenos iontů BENG-membrány

Ionofory pro Ca2+ A23187 * vysoká afinta pro Ca2+ BENG-membrány A23187 * vysoká afinta pro Ca2+ Calcium ionophore IV (Sigma)

Přenos H+ bez přenosu náboje BENG-membrány Nigericin * tvorba hydrofilní kapsy O-heterocykly * při vazbě kationtu ztrácí H+ * obě formy prochází membránou Monensin * preference pro Na+

Protonofory - přenos H+ a náboje BENG-membrány Protonofory - přenos H+ a náboje FCCP = carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenyl-hydrazone „rozpojovače, přenašeče H+“ průchod díky systému -elektronů zvýšení propustnosti membrány pro protony vede ke zkratu obvodu a rozpojení tvorby p od syntézy ATP zvýšení protonové vodivosti těmito látkami bylo v souladu s chemiosmotickou teorií rozpojení může být dosaženo kombinací ionoforů např. valinomycin a nigericin

Příklady funkce – nigericin a FCCP BENG-membrány Příklady funkce – nigericin a FCCP c) Elektroneutrální přenos H+ d) Cyklování protonoforu

Lipofilní kationty a anionty BENG-membrány Lipofilní kationty a anionty TPP+ = tetrafenylfosfoniový kation TPB- = tetrafenylborátový anion Využití schopnosti -elektronů „odstiňovat“ elektrický náboj při průchodu lipidickou dvojvrstvou VÝZNAM: nejsou ionofory, ale akumulují se při existenci membránového potenciálu = experimentální odhad  fluoreskující lipofilní kationty – sledování MTCH in vitro i v živých buňkách

BENG-membrány TPP a TPB TPP+ TPB-

BENG-membrány Transportní proteiny Specifika: Analogie enzymům (inhibice, stereospecifita, genetika) Individuální, orgánová a tkáňová odlišnost (např. citrátový přenašeč – pouze jaterní MTCH) Používání synonym pro transportní proteiny: „Přenašeče“ x neodpovídá funkci přenašeče definované u ionoforů „Permeasy“, „Translokasy“ - Většina transportních proteinů tvoří dimery a přenos látek se děje konformačními změnami proteinů

„Kyvadlová doprava MTCH- CYT“ BENG-membrány „Kyvadlová doprava MTCH- CYT“

Osmotické bobtnání MTCH BENG-membrány Základní princip: pouze malé odchylky od rovnovážného rozdělení iontů – vznik velkých potenciálů (1 nmol iontu =  >200mV) a) probíhá vždy, pokud nejsou MTCH v isotonickém prostředí, které navíc neobsahuje permeabilní ionty b) zahrnuje rozvinutí vnitřní membrány až do prasknutí vnější membrány c) pozoruje se jako změny optických vlastností suspenze MTCH

Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 1 BENG-membrány Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 1 1) nepropustnost Cl-

Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 2 BENG-membrány Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 2 1) nepropustnost Cl- 2) propustnost SCN-

Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 3 BENG-membrány Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 3 1) nepropustnost Cl- 2) propustnost SCN- 3) reflux H+ po FCCP

Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 4-5 BENG-membrány Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 4-5 5) srovnej s nigericinem 4) FCCP nutný pro H+ tok

Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 6-7 BENG-membrány Bobtnání MTCH – ionofory a metabolity 6-7 7) kontrakce po přídavku nigericinu a substrátu: propustnost pro NO3- 6) propustnost pro acetát

Fyziologický význam bobtnání MTCH BENG-membrány Fyziologický význam bobtnání MTCH Přídavek TNF- ke kultuře lidských hepatocytů: Tvorba ROS (změna červená – žlutá-zelená barva) Bobtnání MTCH = změny v propustnosti vnitřní membrány

Příště: Vzpomínky na fyzikální chémii