Transplantace hematopoetických kmenových/progenitorových buněk a její komplikace Prof. RNDr. Ilona Hromadníková, Ph.D. Oddělení molekulární biologie a patologie buňky, 3.LF UK ilona.hromadnikova@lf3.cuni.cz

Historie 1891 podání kostní dřeně perorálně nemocným s poruchami krvetvorby 1939 intravenózní infúze buněk kostní dřeně 50. léta – experimentální pokusy na zvířatech druhá polovina 50. let – první klinické pokusy neúspěchy → nebyl dosud znám HLA systém 1960 první TKD u nás v ÚVN v Praze u akutní leukemie tvorba postupů k přípravě konzerv kostní dřeně, koncepce registru dobrovolných dárců dřeně zlom s objevem HLA systému – „moderní éra“ (druhá polovina 60. let) alogenní TKD HLA-identických sourozenců Snaha použít kostní dřeň k léčbě je starší více než 100 let. Převod buněk kostní dřeně intravenózní infúzí byla uskutečněna již v roce 1939, ale na tuto zkušenost se na mnoho let zapomnělo. Používání alogenní Tx kostní dřeně v klinice spočívá převážně na výsledcích výzkumných prací 50.let, kdy bylo např. prokázáno, že supraletálně ozářená zvířata lze ochránit před aplazií kostí dřeně stíněním sleziny během ozařování nebo následným podáním buněk kostní dřeně. Tím se otevřela cesta pro koncepci terapeutického používání alogenní kostní dřeně, která se skutečně ve druhé polovině 50.let začla zkoušet, ale výsledky byly skličující, protože tehdy ještě nebyl znám HLA systém. U nás byla první TKD provedena v roce 1960 v ústřední vojenské nemocnici v Praze, začly se také tvořit postupy k přípravě konzerv s kostní dření i koncepce registru dobrovolných dárců dřeně. Zlom nastal počátkem 60.let s objevem HLA systému a rozvoj metod k jeho průkazu vedl ve druhé polovině 60.let ke vnizku tzv. moderní éry alogenní TKD s koncepcí přenosu KD HLA-identických sourozenců.

Historie vývoj experimetální a klinické realizace: E.D. Thomas (1990 Nobelova cena za medicínu) - infúze buněk KD bezpečná - dřeň lze konzervovat - dlouhodobá rekonstituce buněk u příjemce závisí na stupni histokompatibility - imunosupresivní léčba může tlumit u příjemce tzv. reakci štěpu proti hostiteli - léčebný účinek i ve velmi pokročilých stadiích leukemie, účinnější v časném stadiu onemocnění 1968 první TKD s HLA-identickou sourozeneckou dření v Seattlu, USA léčba nejen pro maligní hematologická onemocnění, později i aplazie dřeně, solidní nádory, některé vrozené metabolické poruchy a další O vývoj experimetální a klinické realizace Tx se zasloužila především pracovní skupina prof. Thomase, která prokázala, že transfúze buněk KD je po odpovídajícím zpracování bezpečná…První TKD s HLA-identickou sourozeneckou dření byla provedena v roce 1968 v Seattlu. Od té doby se rychle zvětšoval význam TKD při léčbě maligních hematologických onemocnění, později i aplazií dřeně, solidních nádorů, některých vrozených metabolických poruch a dalších.

Historie 1976 první TKD s vyšetřením HLA-kompatibility v Hradci Králové 1991 první TKD s pomocí kostní dřeně nepříbuzenského dárce ze zahraničního registru, Ústav hematologie a krevní transfúze v Praze 1989 – rozvoj transplantací na II. dětské klinice v Motole 1991 – samostatná Transplantační jednotka v Motole 1991 – plzeňská fakultní nemocnice (alogenní, autologní Tx) 1993 – Hradec Králové (autologní Tx) 1993 – I. Interní klinika 1.LF UK v Praze (autologní Tx u maligních lymfomů, lymfomů a později i karcinomů prsu) 1994 – II. Interní klinice v Brně Bohunicích 1995 – hematologická klinika v Olomouci U nás byla provedena první TKD s vyšetřením HLA-kompatibility v roce 1976. První TKD s pomocí kostní dřeně nepříbuzenského dárce ze zahraničního registru byla provedena na pražském UHKT. V roce 1989 se rychle rozvinula Tx léčba na II. dětské klinice v Motole, kde v roce 1991 vzniklo samostatné Tx pracoviště, které soustřeďuje pediatrické onkologické pacienty. A začínají se rozvíjet další pracoviště v Plzni, Hradci Královém, v Praze, Brně a Olomouci.

Základní pojmy transplantace hematopoetických kmenových buněk cílem je osídlit dřeň příjemce kmenovými buňkami dárce, které dají vznik celé krvetvorbě nahrazení původního termínu Tx kostní dřeně dárce – jedinec, ze kterého pochází transplantované buňky (= štěp) myeloablace – před Tx nutné ve většině případů „uvolnit“ prostor v kostní dřeni a zničit vadné kmenové buňky příjemce (ozářením nebo farmakologicky) přihojení – detekovatelná dárcovská krvetvorba rejekce – odvržení štěpu, projeví se zástavou krvetvorby od dárce a obnovou krvetvorby příjemce Transplantace hematopoetických kmenových buněk nahrazuje původní termín Tx kostní dřeně, neboť dnešní techniky umožňují získat kmenové buňky nejen z kostní dřeně, ale také z pupečníkové krve nebo z periferní krve dárce po stimulaci růstovými faktory.

Základní pojmy reakce štěpu proti hostiteli (graft versus host disease, GvHD) – T lymfocyty ve štěpu rozpoznají tkáňové antigeny příjemce jako cizorodé a reagují proti nim reakce štěpu proti leukemickým buňkám (GvL) – reaktivita T lymfocytů přenesených společně s kmenovými buňkami vůči zbytkovým leukemickým buňkám příjemce relaps - návrat příznaků nemoci remise - dosažení bezpříznakového období, předpokládá se, že nemoc je stále přítomna, ale bez zjevných symptomů

Podstata léčby různé lymfo-hematopoetické malignity: zničení patologické krvetvorby intenzivní, většinou cytostatickou a radiační přípravou s následnou obnovou krvetvorby přenosem kmenových buněk od zdravého shodného dárce vrozené poruchy obranyschopnosti (imunodeficience), vrozené a získané poruchy krvetvorby, dědičné poruchy metabolismu: náhrada defektních kmenových hematopoetických buněk příjemce normálními buňkami dárce, schopnými vytvářet chybějící buněčnou linii nebo buněčný produkt samotná Tx technicky jednoduchá – suspenze směsi částečně čištěných buněk se injikuje do periferní žíly příjemce a kmenové buňky si najdou cestu do kostní dřeně a usídlí se tam

Druhy transplantace Zdroj buněk autologní syngenní alogenní xenogenní kostní dřeň periferní krev pupečníková krev možno použít i kombinace pro jednu Tx

Druhy transplantace Autologní Tx převod vlastních kmenových buněk odebraných nemocnému před zahájením přípravného režimu před Tx použití tam, kde není štěp vůbec infiltrován základním onemocněním (nesmí obsahovat nádorové buňky) nebo je dosaženo kvalitní remise reakce štěpu proti hostiteli vzácné, ale mohou se vyskytnout chybí nebo je sníženo imunitní působení štěpu na leukemický proces, riziko vzniku relapsu základního onemocnění je větší než u alogenních Tx

Druhy transplantace Syngenní Tx převod kmenových buněk jednovaječného dvojčete genetická identita nevyvolává imunologické reakce chybí GvL efekt

Druhy transplantace Alogenní Tx Xenogenní Tx převod kmenových buněk od - sourozenců - dalších členů rodiny - nepříbuzných dárců Xenogenní Tx převod kmenových buněk mezi jedinci různých živočišných druhů, v klinice se rutinně nepoužívá

Odběr štěpu dárce štěpu pro alogenní Tx pacient - autologní Tx vyšetření kromě testů na HLA, AB0, RhD kompatibilitu i celkově klinicky (schopnost podstoupit celkovou anestezii – odběr dřeně) krevní obraz, krevní skupina, screening na atypické protilátky testy na hepatitidu B, C, syfilidu, HIV 1+2, CMV, herpex simplex, herpes zoster, toxoplazmózu odběr krve (7 – 21 dní před Tx) pacient - autologní Tx pacient je léčen homologními krevními preparáty (krev vykřížená a ozářená pro minimalizaci rizika vzniku GvHD) odběr dřeně v celkové nebo epidurální anestezii z dorzálních a laterálních kyčelních kostí, asi 1 – 5 ml dřeňové krve

Doporučená minimální množství odběru kmenových buněk vyjadřuje se jako počet jaderných buněk na kilogram hmotnosti příjemce pro autologní Tx min. 1,5x108 buněk/kg pro HLA-identické sourozenecké Tx pro leukémie, hemoglobinopatie a vrozené poruchy metabolismu min. 1,5 – 2x108/kg pro aplastickou anémii min. 3x108/kg pro nepříbuzenské alogenní Tx min. 2-3x108/kg má-li být štěp kryokonzervován nebo jinak zpracován – zvýšit počet nejméně o 30% každé transplantační centrum své údaje, jaká min. dávka je dostačující v jeho konkrétních podmínkách

Rizika odběru kostní dřeně malé, z analyzovaných 1270 odběrů vážnější komplikace u 0,27% z toho polovina život ohrožujících komplikací způsobena celkovou anestezií, zbytek hlavně infekce Zpracování odebrané kostní dřeně při inkompatibilitě AB0 odstranit erytrocyty nebo plazmu koncentrovat kmenové buňky před kryokonzervací (separace buffy coatu) odstranit T lymfocyty s cílem zmenšit riziko vzniku GvHD (separace monoAb), používá se jen u HLA neidentických Tx odstranit nádorové buňky (čištění dřeně) nejčastěji monoAb nebo 4-hydroperoxycyklofosfamidem (tzv. negativní selekce) – používá se u auto Tx pozitivní selekce kmenových buněk – izolace pouze buněk krvetvorby (separace monoAb proti CD34)

Kryokonzervace kostní dřeně odebranou, nezpracovanou lze uchovat při 2-4°C až 72 hod, klesá ale životnost leukocytů a progenitorových buněk nutnost uchování delší dobu: u autoTx ke zkrácení aplastické fáze po chemoterapii hematologických malignit, při odběru dřeně v remisi pro případ relapsu zmrazení v tekutém dusíku (-196°C), jeho parách (-140°C) nebo v mrazáku při -80°C ve vacích ze speciálního materiálu (5-10% DMSO - kryoprotektivní účinky) přeprava ve speciálních nádobách před použitím nechat roztát ve vodě 37-40°C asi 15 min

Progenitorové buňky periferní krve pluripotentní kmenová buňka - předchůdce vývojových řad krevních buněk, tvoří progenitorové buňky již zadané pro hlavní vývojové linie dřeňové krvetvorby jsou CD34+, tvoří asi 0,2% mononukleárních buněk (1/10 kostní dřeně) u zdravého jedince zvýšení koncentrace v krvi, tzv. mobilizace: myelosupresivní chemoterapií (cyklofosfamid) – 10-100x vyšší c (pouze u pacientů) pomocí cytokinů (G-CSF, GM-CSF, často v kombinaci s IL-3) – menší výtěžky (u zdravých dárců pouze tento způsob) kombinací cytostatik a cytokinů – největší výtěžek odběr pomocí separátorů: určení doby odběru monitorací CD34+ buněk, vzestupu počtu neutrofilů velikost výtěžku ovlivněna počtem a intenzitou předchozí cytostatické léčby, předchozí radiační léčbou, věk nemocného aj. pro autologní Tx – plánované odběry při chemoterapii

Přehled hematopoézy CFU – colony forming unit BFU – burst forming unit Colony forming unit – název podle stanovení v kultuře (klonální metody v semisolidních kulturách) na základě tvorby kolonií, protože jinak nelze rozeznat morfologicky od jiných buněk podobných lymfocytům CFU – colony forming unit BFU – burst forming unit

Výhody Tx s PBPC vůči autologní TKD: rychlejší přihojení štěpu, menší nároky na podpůrnou léčbu krevními deriváty a antibiotiky použití i pro alogenní Tx (na základě dobré snášenlivosti stimulace růstovými faktory i leukaferézy) mobilizace PBPC zdravého dárce: G-CSF obvykle více CD34+ než z kostní dřeně, negativní ovlivnění výtěžku věkem dárce výhody pro dárce – odběr ambulantně bez použití celkové anestezie G-CSF malé nežádoucí účinky výhody pro příjemce – rychlejší rekonstituce krvetvorby Tx od nepříbuzných dárců – větší riziko vzniku GvHD díky velkému množství T-lymfo v transplantátu (přesný vztah neprokázán)

Použití pupečníkové krve k Tx zdroj pluripotentních hematopoetických kmenových buněk obsahuje buňky bez markerů zralých hematopoetických linií a současně exprimují CD34 získání obvykle po porodu před vypuzením placenty krev získaná při 1 porodu obsahuje takové množství progenitorových a kmenových buněk srovnatelné s množstvím buněk kostní dřeně potřebných pro auto i alo Tx dospělého člověka možnost kryokonzervace, uchování v bankách (malá množství díky separacím), prokázán zachovaný repopulační potenciál po 7 letech skladování imunitní nezralost buněk – výhodou: méně post-Tx komplikací (GvHD) nevýhodou: slabší účinek proti nádoru (GvL efekt), delší přihojování a rekonstituce IS

Přípravné režimy Cíle: tumorablativním účinkem přispět k eradikaci základního onemocnění výrazně utlumit imunitní systém tak, aby nedošlo k rejekci transplantátu vytvořit „prostor“ pro transplantát ve spongiózních dutinách kostí

Přípravné režimy Celotělové ozáření (TBI) v praxi mnoho variant výsledný protokol – únosná toxicita, malé riziko sekundárního maligního onemocnění Celotělové ozáření (TBI) základem přípravných schémat, lepší výsledky v kombinaci s cyklofosfamidem při konvenčních dávkách není možné zcela zničit leukemické buňky význam při působení na buňky v G0-fázi a v místech špatně dostupných pro cytostatika (CNS, varlata) nejúčinnější k zabránění rejekce kmenových buněk celková dávka různá: 5-14 Gy (nejčastěji kolem 10 Gy) – závisí na porovnání výhod a nevýhod ve zvolené kombinaci režimu častější použití frakcionované dávky: 6 frakcí po 2 Gy během 3 dnů

Následky celotělového ozáření zvracení, průjem (2. - 10. den) mukositis, maximum vzniku kožních příznaků okolo 10.dne > 4 Gy vznik alopecie (obnova růstu po 3 měsících) letargie, bolesti hlavy (6. - 8. týden) pozdní následky ozáření nejvýznamější u dětí - podle možností se TBI nepoužívá (používá se hlavně u high-risk leukémií) pokud relativní kontraindikace TBI (předchozí radioterapie, respirační funkční poruchy) nebo hrozí těžké poškození organismu (porucha růstu u dětí, těžká toxicita u starých pacientů) → chemoterapeutické přípravné režimy: busulfan a cyklofosfamid, BCNU, cyklofosfamid a etoposid aj. neustálé zdokonalování režimů: ↑ tumorablativní účinnost a ↓ toxicita

Příklady přípravných režimů Režimy obsahující TBI (den 0 = den Tx) Protokol Cy/TBI cyklofosfamid 60mg/kg ve dnech -7 a -6, TBI 2 Gy ve dnech -5, -4, -3, -2, -1 a 0 nejdéle používán u hematologických malignit, měnila se TBI – nyní frakcionovaně ve větších dávkách (12-14 Gy) Protokol Mel/TBI melfalan 140mg/m2 v den -1 i., v. po 12h, TBI 9,5-11,5 Gy v jedné frakci použití u maligních onemocnění, např. u myelomu

Příklady přípravných režimů Režimy neobsahující TBI Protokol Bu/Cy busulfan 4mg/kg ve dnech -9, -8, -7, -6; cyklofosfamid 50mg/kg -5, -4, -3, -2 použití u maligních onemocnění různého druhu Protokol CCB cyklofosfamid 5625 mg/m2 (celková dávka na 4 dny) ve dnech -6, -5, -4, -3; cisplatina 165 mg/m2 (celková dávka na 4 dny) v kontinuální infúzi ve dnech -6, -5, -4, -3; BCNU 600 mg/m2 v den -3 použití u autologních Tx u solidních nádorů

Klinický průběh po Tx Časné stadium po Tx Vlivem vysoké toxicity přípravného režimu: úplná aplázie hematopoetického a lymfatického systému → intenzivní podpůrná léčba akutní nehematologická toxicita: slizniční záněty a nekrózy různé intenzity venookluzivní nemoc – projev: hepatomegalie, hyperbilirubinémie, trombocytopenie, vzrůst tělesné hmotnosti díky tvorbě edémů časná plicní toxicita „capillary leak“ syndrom – poškození endotelu malých cév klinický projev: orgánové nebo generalizované postižení kapilár

Další vlivy vysoké toxicity přípravného režimu poruchy reproduktivních gonadálních funkcí u mužů – tvorba testosteronu normální nebo normalizace po určité době (provádí se preventivně zamražení spermatu) u žen – nedostatek estrogenů (substituční léčba) u dětí poruchy růstu časté poškození funkce štítné žlázy až v 80% katarakty oční čočky během několika let po Tx ? riziko vzniku sekundárních malignit

Rekonstituce imunitního systému závisí na čase po Tx a druhu Tx (autoTx - rychlejší rekonstituce), přípravném režimu, vzniku a léčbě GvHD, infekcích ontogeneze imunity podobná jako po narození regenerace krvetvorby během 2 – 3 týdnů po Tx období nejtěžší imunodeficience granulocyty 1. přihojené buňky NK buňky 1. lymfoidní přihojené buňky (10. – 20. den po Tx) lymfocyty 1 – 3 měsíce po Tx normalizace počtu rychlost obnovy funkce buněk různá NK buňky – během 20 dnů po Tx úplná obnova funkce T, B lymfocyty – úplná obnova funkce 1 rok až několik let normalizace všech subpopulací počátkem 2. roku po Tx bez komplikací

Nemoc štěpu proti hostiteli (graft versus host disease, GvHD) hlavní komplikace po alogenní Tx příčinou neúplná shoda v HLA systému nebo neshoda v antigenech nekódovaných hlavním systémem histokompatibility akutní GvHD v 30-60% případech u HLA indentických Tx i přes imunofarmakologickou profylaxi (výskyt do 100. dne po Tx) klinický projev: postižení kůže, jater, trávicího ústrojí intenzivní imunosupresivní léčba → ohrožení infekcemi chronická GvHD – vznik nově nebo po aGvHD (výskyt po 100. dni po Tx)

Toxická nebo infekční postižení plic v podobě intersticiální pneumonie častější u alogenní Tx, při aGvHD, u nemocných vyššího věku, při jednorázovém TBI a u nosičů cytomegalovirové infekce (v polovině 80. let ve 20-40% hl. příčinou úmrtí po alogenní Tx) Ohrožení infekcemi a trombocytopenickým krvácením V polovině 80. let byly plicní komplikace ve 20-40% hl. příčinou úmrtí po alogenní Tx. Později došlo k poklesu na přibližně 10%, příčina není jednoznačná. Pravděpodobně díky zavedení frakcionovaného TBI a stínění plic a hlavně zřejmě díky zdokonalení metod časné diagnostiky a léčby CMV.

Hlavní klinické problémy transplantace Orgánový systém Nežádoucí účinky akutní chronické kostní dřeň aplazie dřeně, infekce, krvácení   GIT nevolnost, zvracení, průjmy, orofaryngeální a intestinální změny chronická GvHD GIT kůže alopecie, poruchy růstu nehtů, akutní GvHD kůže chronická GvHD kůže, suchost sliznic plíce alveolární hemoragie, intersticiální pneumonie plicní fibróza, obliterující bronchiolitida játra venózní okluzívní nemoc, akutní selhání jater, akutní GvHD chronická GvHD jater cévní systém "capillary leak" syndrom močové cesty, ledviny hemoragická cystitida, poruchy funkce, akutní selhání lymfatický systém porucha buněčné i humorální imunity imunitní defekt při chronické GvHD oči suchost spojivek, katarakta endokrinní poruchy endokrinní a reprodukční poruchy gonád, hypotyreóza hypotyreóza, nedostatek estrogenů, sterilita