Mikroskopická technika Vladimír Hampl, Veronika Sacherová, Pavel Němec
Co vás tu čeká? Světelná mikroskopie (V. Hampl kol.) Speciální světelná a elektronová mikroskopie (V. Hampl a kol.) Základy obrazové analýzy (P. Němec a R. Černý) Počítání mikroskopických objektů (V. Sacherová a kol.)
Co potřebujete na zápočet? Minimálně 75% účast na praktiku Odevzdání protokolů vypracovaných během cvičení Nákresy dělejte velké, Kreslete, co vidíte v mikrokopu a ne, co je v naší prezentaci, nestínujte, nešrafujte.
Doporučené studijní materiály Naše webové stránky, kde jsou uvedeny prezentace k přednáškám i odkazy na literaturu: http://natur.cuni.cz/parasitology/parpages/mikroskopickatechnika/
Něco navíc o světelné mikroskopii Knihy a skripta: Dušan Matis a kolektív: Mikroskopická technika. Skriptum PřF Univerzity Komenského, 1993 Jaromír Plášek: Nové metody optické mikroskopie. Skriptum Fyzikálního ústavu Univerzity Karlovy Petr Smékal: Experimentální metody biofyziky II, Světelná a elektronová mikroskopie. Skriptum PřF Ostravské Univerzity, 1995 Časopis Vesmír: Mikroskopy, věda, průmysl... 1997/10, str. 576 Mikroskopie (barevná dvojstrana uprostřed časopisu). 2004/3 Jaromír Plášek: Proměny světelné mikroskopie ve 20. století. 2004/3, str. 146 A samozřejmě internet!!! Například stránky firem vyrábějících mikroskopy
Světelná mikroskopie
Krátký pohled do historie mikroskopování 1590-1610 bratři Janssenové, první mikroskop 17. -18. století A. Leeuwehoek 1847 průmyslová výroba mikroskopů firmou Zeiss 1911 C. Reichert, fluorescenční mikroskop s UV excit. 1932 F. Zernick, fázový kontrast 1955 Nomarski, diferenciální interferenční kontrast 1968 rastrovací tandemový konfokální mikroskop 1978 laserový konfokální rastrovací mikroskop
Krátký pohled do historie mikroskopování Leeuwehoekův mikroskop
Krátký pohled do historie mikroskopování Hookův mikroskop cca 1678
Světlo Vlnový model (elektromagnetické vlnění) Způsoby popisu ve fyzice: Vlnový model (elektromagnetické vlnění) Kvantový model (proud fotonů) Geometrický model (světelný paprsek)
Světlo Rychlost (c) Ve vakuu 3 x 108 m/s Vlnová délka (l) Vzd. mezi odpovídajícími si body sinusoidy Amplituda (A) Největší odchylka sinusoidy od nulové hodnoty Fáze (f) Udává v jaké části sinusoidy se vlnění nachází v urč. časovém úseku Frekvence (f) Počet kmitů za jednotku času
Světlo
Interference a ohyb (difrakce) světla
Interference a ohyb (difrakce) světla
Interference a ohyb (difrakce) světla
Odraz a lom světla úhel dopadu = úhel odrazu
Odraz a lom světla řidší prostředí hustší = lom ke kolmici
Odraz a lom světla = lom od kolmice řidší prostředí hustší
Čočka Světelné paprsky šířící se z určitého bodu předmětu různými směry a dopadající na čočku se v obrazové rovině sbíhají opět do jednoho bodu a skládají tak ostrý obraz předmětu
Čočka čočka Ohnisko (F) Optická osa ohnisková rovina rovina čočky vzdálenost Ohnisko (F) ohnisková rovina Optická osa rovina čočky
Čočka
Čočka – vznik obrazu Objektiv předmět mezi F a 2xF Okulár, lupa Skutečný a převrácený obraz F f F Zdánlivý obraz Předmět blíže než ohnisko (F) čočky Okulár, lupa
Vznik obrazu ve světelném mikroskopu zdánlivý a zvětšený obraz skutečný, převrácený a zvětšený obraz Pozorovatel/ka uvidí v mikroskopu: zdánlivý, zvětšený a převrácený obraz
Vznik obrazu ve světelném mikroskopu Pozorovatel/ka uvidí v mikroskopu: zdánlivý, zvětšený a převrácený obraz
Vznik obrazu ve světelném mikroskopu Fyzikální podstata vzniku obrazu v mikroskopu: Ernst Abbe (1873): poměrně složitá teorie, založená na využití Huygensova principu a interferenci transformovaných světelných vln procházejících preparátem
Zvětšení světelného mikroskopu Zvětšení objektivu x zvětšení okuláru
Zvětšení světelného mikroskopu numerická apertura zvětšení Maximální užitečné zvětšení Závisí na rozlišovací schopnosti objektivu
Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu Vzdálenost dvou bodů, které mikroskop zobrazí jako dva samostatné body a = 0,61 l/ n x sina l - vlnová délka n – index lomu prostředí před objektivem a - polovina otvorového úhlu kužele paprsků, které mohou vstoupit do objektivu numerická apertura Rozlišovací schopnost lze zvýšit: snížením λ použití modrého světla (modrý filtr) zvyšováním n použití imerzního oleje
světla Ovlavač intenzity světla Hlavní vypínač
Preparát č. 1: Amoeba proteus Zvětšení:
Preparát č. 2: NAKRESLIT!!! Paramecium caudatum Zvětšení:
Typy objektů Amplitudové = zbarvené objekty absorbující světlo - rovnoměrně různé části světelného spektra, jeví se jako tmavé - různě, jeví se jako barevné Fázové = nebarevné objekty, lišící se indexem lomu a tloušťkou Jejich kontrast lze zvýšit - barvením preparátů - optickými metodami
Barvení preparátů Nativní Trvalé možno barvit vitálně Roztěry Živé buňky – nutno použít vhodný fyziol. roztok (savci a ptáci 0,85%, obojživelníci 0,64%, pufrovaný fyz. roztok PBS...) možno barvit vitálně karmín – potravní vakuoly mitotracker – mitochondrie metylénová modř – odlišení živých a mrtvých bb, živé se neobarví Trvalé Musí se fixovat – proti posmrtným změnám bb a tkání při zachování barvitelnosti denaturací bílkovin se zpevní a zakonzervují bb struktury Roztěry Suchý r. –fixace po zaschnutí (methanol), 2D objekty Vlhký r. – fixace za vlhka (Bouin-Holland, sublimát, aj.), 3D objekty Celkové preparáty Kus tkáně Malý živočich (fix. Alkohol 70-80% či formaldehyd 4% Typy barviv: pH kyselá: eosin, světlá zeleň, kyselý fuchsin, kyselina pikrová zásaditá:metylénová modř, toluidinová modř, bazický fuchsin neutrální: Giemsa-Romanowski, různé formy stříbra objekt barvení motolice a tasemnice:borax-karmín prvoci: Giemsa-Romanowski, protargol, hematoxylin tkáně: hematoxylin-eosin
Nativní preparát: Tetrahymena pyriformis karmín Trvalé preparáty: Tetrahymena pyriformis opálová modř Trypanosoma carassi Giemsa-Romanowski Tritrichomonas foetus Giemsa-Romanowski
Trvalé barvení: Suchý roztěr Trypanosoma carassi Tritrichomonas foetus pro barvení Giemsa-Romanowski
Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ Trvalé barvení Giemsa-Romanowski : Trypanosoma carassi Tritrichomonas foetus Fixáž methanol 3´ Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ Po oschnutí pozorování preparátu
Preparát č. 3: Trypanosoma sp.
Preparát č. 4: Tritrichomonas foetus
Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ Trvalé barvení Giemsa-Romanowski : Trypanosoma carassi Tritrichomonas foetus Fixáž methanol 3´ Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ Po oschnutí pozorování preparátu
Preparát č. 5: Tetrahymena pyriformis Barvení: karmín
Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ Trvalé barvení Giemsa-Romanowski : Trypanosoma carassi Tritrichomonas foetus Fixáž methanol 3´ Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ Po oschnutí pozorování preparátu
Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ Trvalé barvení Giemsa-Romanowski : Trypanosoma carassi Tritrichomonas foetus Fixáž methanol 3´ Po zaschnutí barvení rozt. Giemsa- Romanowski (Sigma) 20-60´ Omytí preparátu pod tekoucí vodou 1´ Po oschnutí pozorování preparátu
Imerzní olej
Imerzní olej Předejdeme ztrátám světla Do objektivu dopadne větší množství paprsků Obraz obsahuje víc detailů
Imerzní olej
Preparát č. 6: NAKRESLIT!!! Tetrahymena pyriformis Barvení: opálová modř Zvětšení: cytostom řasinkové rýhy vakuola
Preparát č. 7: NAKRESLIT!!! Trypanosoma carassi Barvení: Giemsa-Romanowski Zvětšení: jádro kinetoplast undulující membrána
Preparát č. 8: NAKRESLIT!!! Tritrichomonas foetus Barvení: Giemsa-Romanowski Zvětšení: přední bičíky axostyl volný zadní bičík jádro undulující membrána kosta pelta