Genomika hospodářských zvířat

QTL pro rezistenci a/nebo citlivost vůči leishmanióze a jiným infekcím u myší

QTL pro hybridní sterilitu samců u myší White et al. 2011, Genetics

Jemné genetické mapování • Abychom v genetickém mapování pomocí BC1 či F2 generace získali rozlišovací schopnost cca 1 cM, je třeba analyzovat velké množství jedinců (~ 100) za použití jemné genetické mapy (~ 1 marker/1cM) - to je příliš! • Obvykle se genetické mapování provádí ve dvou krocích. V prvním kroku analyzujeme menší množství jedinců (cca 30) za použití hrubé genetické mapy (~ 1 marker/10cM). - nízká rozlišovací schopnost – desítky cM. V druhém kroku analyzujeme větší množství jedinců, genotypujeme však pouze markery v kandidátní oblasti. - zúžení kandidátní oblasti na zhruba 1cM. - umožňuje přechod z genetického mapování (cM) na fyzikální mapování (bp). • Součástí jemného genetického mapování je často vytvoření kongenního kmene. - umožňuje funkční analýzu hledaného genu.

Fyzické mapování • Sekvenování kritické oblasti vymezené genetickým mapováním. • Klonování DNA do vektorů (BAC, YAC). Sestavování získaných sekvencí do kontigů. Anotace získané sekvence. • Určení pozice markerů na fyzikální mapě. • V dnešní době už většinou netřeba. Fyzická mapa u organismů s přečteným genomem je známá.

Ověřování kandidátních genů • Vytvoření seznamu kandidátních genů v kritické oblasti • Hledání polymorfismů korelujících se sledovaným genotypem - nesynonymní mutace v kódujících oblastech - změny genové exprese • Testování vlivu jednotlivých genů či SNP na fenotyp pomocí transgenoze či knock-out

Další metody vazebné analýzy pomocí laboratorního křížení Konsomické kmeny (Chromosomálně substituční kmeny) 10 generací zpětného křížení za současné selekce přenášeného chromosomu

Vazebná analýza pomocí konsomických kmenů • Příprava konsomických kmenů zdlouhavá a pracná (10 generací křížení, nutnost genotypovat každou generaci) • Jakmile ale kmeny hotové, mapování je rychlé a bez nutnosti genotypování. • Nízká rozlišovací schopnost mapování (celý chromosom). Pro jemnější mapování potřeba další křížení. • Z konsomického kmene lze snadno vytvořit kongenní kmen.

Konsomický (consomic) kmen je inbrední kmen, u nějž je jeden z jeho chromozomů nahrazen homologním chromozomem jiného inbredního kmene, a to sérií marker asistovaných zpětných křížení. Dva jedinci, kteří se liší pouze v jednom lokusu se nazývají kongenní (congenic) nebo koisogenní (coisogenic).

Kongenní kmeny jsou připravovány laboratorně křížením dvou inbredních kmenů, obvykle myší nebo potkanů, a zpětným křížením potomků po 5-10 generací s jedním z originálních kmenů, označovaným jako kmen recipientní, příjemce. Před každou generací zpětného křížení je prováděna selekce buď na fenotyp nebo genotyp. Tímto způsobem je převeden buď fenotyp nebo specifický chromosomální region (definovaný genotypem) z donorového kmene do jinak uniformního recipientního pozadí. Kongenní myši mohou potom být porovnány s čistým recipientním kmenem s cílem určit, zda jsou fenotypově odlišné pokud probíhala selekce na genotypovou oblast, nebo s cílem identifikovat kritický lokus, pokud probíhala selekce na fenotyp.

Tzv. rychlé kongenní kmeny mohou být vytvořeny v pěti generacích zpětného křížení. V každé generaci se provádí výběr potomstva, které nejen obsahuje požadovaný chromosomální fragment, ale také „ztrácí“ maximální množství genetického pozadí z donorového kmene. Tyto kmeny se někdy označují jako „Marker Assisted“ kongenní, a to pro využití genetických markerů, vět. mikrosatelitů nebo nyní nejčastěji SNP. Proces může být intenzifikován superovulací samic, které potom produkují více vajíček.

Idiogram genomu potkana

Inbrední kmen

Konsomický kmen

Kongenní kmen

Dvojitě kongenní kmen

Zpětné křížení (backcrossing) heterozygotní myši z jednoho genetického pozadí do druhého. V buňkách 129/Sv byl proveden genový knock out, potom zpětné křížení do genetického pozadí C57B/6J. Při každém postupném zpětném křížení se zvyšuje podíl DNA z C57B/6J, která tvoří genom potomstva.

Polydaktylní kmen potkana PD/Cub • Vysoce inbrední model (F > 90) • model vývoje končetiny a teratogeneze • model hypertriglyceridémie, metabolického syndromu • Specifický farmakogenetický a nutrigenetický profil • Model vývojové plasticity metabolického syndromu

Mapování znaků pomocí panelu konsomických kmenů myší odvozených od kmenů B6 a MSM Takada et al. 2008, Genome Research

Genetika laboratorních zvířat Odbočka: Genetika laboratorních zvířat 1. Isogenní - geneticky definované kmeny isogenicita - genetická totožnost všech jedinců 2. Neisogenní - geneticky nedefinované kmeny 3. Kmeny geneticky částečně definované

Isogenní kmeny Inbrední kmeny - vznik příbuzenskou plemenitbou po více než 20 generací (bratr x sestra nebo potomek x jeden z rodičů) - homozygotnost nad 98 % (udávána koeficientem inbreedingu.) - vlastnosti - isogenicita, fenotypová uniformita (nízká variabilita reaktivity), obvykle nízká fertilita, náchylnost k nemocem - výhody v experimentu - homogenní, možnost užití menšího počtu jedinců - nevýhody - riziko, že zjištěné skutečnosti jsou kmenově specifické a neplatí pro jiné kmeny, problematičtější generalizace výsledků Kongenní, koizogenní kmeny; konsomické kmeny - viz výše

Isogenní kmeny Rekombinantně-inbrední kmeny - zkřížení dvou kmenů, z hybridů jsou pak vytvořeny nové linie, které jsou dále kříženy bratr x sestra, vznikne nový inbrední kmen Rekombinantně-kongenní kmeny - zkřížení dvou kmenů, následně 3 zpětná křížení k jednomu z rodičovských kmenů a pak inbredizace křížením bratr x sestra (alespoň 14krát)

Neisogenní kmeny Outbrední linie - geneticky heterogenní populace, nedochází však ke křížení s jedinci jiných linií, v rámci populace se vyhýbáme příbuzenskému křížení, tak aby koeficient inbreedingu zůstával co nejnižší - vlastnosti - určitá fenotypová variabilita (vyšší variabilita reaktivity), vyšší fertilita a odolnost vůči nemocem - výhody - levnější a snazší produkce, obecněji platné nálezy - nevýhody - méně homogenní soubor, nutnost použití většího počtu jedinců Geneticky heterogenní linie - vznikají zkřížením několika inbredních kmenů a následným chovem jako v outbrední populaci Outbrední selektované linie - v outbrední populaci je selektován určitý fenotypový znak Konec odbočky

Rekombinantně inbrední linie (kmen) opakované křížení F1 bratr-sestra (alespoň 20 generací)

Rekombinantně inbrední linie (kmen) samoopylení (alespoň 20 generací)

Vazebná analýza pomocí rekombinantně inbredních linií (RIL) • Příprava sice zdlouhavá (20 generací křížení), ale nemusí se během ní genotypovat. Genotypuje se až konečná generace. • Jakmile hotové, rychlé mapování bez genotypování. • Vysoká rozlišovací schopnost – až 1cM (záleží na počtu vytvořených RIL). • Z RIL nelze snadno vytvořit kongenní kmen.

Mapování genů podmiňujících bílou korunku u WSB/EiJ

Vazebná analýza pomocí rodokmenů • Je třeba dostatek rodokmenů, ve kterých segreguje studovaný znak (choroba). • Rozlišovací schopnost daná počtem meióz zachycených v rodokmenech. Obvykle nízká (~1-10cM). • Vhodné pro mapování znaků s jednoduchou Mendelovskou dědičností, ne však kvantitativních znaků.

Identifikace genu odpovědného za cystickou fibrózu pomocí analýzy rodokmenů. Science (1985)

(LD mapování, haplotypové mapování) Asociační mapování (LD mapování, haplotypové mapování) • Mapování v přírodních populacích na základě vazebné nerovnováhy (linkage disequilibrium, LD) ke genetickým markerům. • Je potřeba velmi vysoký počet markerů (~ 1 mil). • Přesný počet markerů závisí na míře LD v genomu (čím větší LD tím míně je potřeba markerů). - LD nepřímo úměrně závisí na míře rekombinace a efektivní velikosti populace - LD je větší kolem nedávno vzniklých výhodných mutací • Míra LD se mění podél genomu a tomu by mělo odpovídat rozložení markerů.

Haplotypová mapa lidského genomu (HapMap projekt) • určen genotyp více než 1 mil SNP rozmístěných každých 5 kb v genomu u více než 250 jedinců z několika populací • zjištěno, že genom je rozdělen do bloků (haplotypů) s vysokým LD (tzn. uvnitř těchto bloků téměř nejsou rekombinace). Hranice mezi jednotlivými bloky korelují mezi populacemi a odpovídají rekombinačním hotspotům. • Výsledky ukazují, že pro asociační mapování je třeba genotypovat ~ 0.5 mil SNP u Evropské populace a 1 mil SNP u Africké populace (tj. kapacita jednoho SNP genotypovacího čipu )

Asociační mapování • Má vysokou rozlišovací schopnost (~10kb). • Vhodné i pro mapování kvantitativních znaků. • Třeba analyzovat velký počet jedinců (~ 1000). • Důležité mít správnou kontrolní skupinu (pozor na populační strukturu). • Málo účinné pouze při mapování alel s velmi nízkou frekvencí v populaci a velmi komplexních fenotypů podmíněných velmi velkým množstvím genů s malými účinky.

Asociační studie sedmi chorob v britské populaci The Wellcome Trust Case Control Consortium, Nature 2000

Asociační studie sedmi chorob v britské populaci

Ideální je kombinace obou přístupů Vazbová analýza - nízký počet genetických markerů (~ 100) - nízká rozlišovací schopnost (~ 10 cM) Asociační mapování - vysoký počet genetických markerů (~ 1 000 000) - vysoká rozlišovací schopnost (~ 10 kb) Ideální je kombinace obou přístupů 1. vazebná analýza 2. Asociační mapování Hrubé genetické mapování - na úrovni celého genomu Jemné genetické mapování - lze omezit jen na určitou předem vybranou oblast

Jak rychle nalézt gen odpovědný za určitý fenotyp bez pozičního klonování Metoda kandidátních genů • Vytvoření seznamu genů, které by mohly mít nějakou souvislost s pozorovaným fenotypem. • Hledání polymorfismů a jejich korelace s fenotypem. • Takto objeveny geny podmiňující některé lidské nemoci (např. geny pro srpkovitou anémii) i některé geny pro adaptivní znaky (např. geny podmiňující různou barvu srsti u hlodavců). • Tento přístup lze použít jen u některých fenotypů. Nelze nalézt geny, jejichž funkce je neznámá. Pytlouš skalní, obvykle světlý, na lávových polích černé populace. Černé zbarvení vzniká mutací v genu melanocortin-1-receptor gene (Mc1r), ale jen v některých populacích. V jiných populacích způsobuje černé zbarvení mutace v jiném genu zatím neznámém (Nachman et al. PNAS 2003).