STRATEGIE MOLEKULÁRNÍ GENETIKY Kolektiv Laboratoře molekulární biologie Onkologické centrum J. G. Mendela Nový Jičín

PŘÍMÁ DNA DIAGNOSTIKA hledá se kauzální mutace - musí být známá sekvence genu / oblasti - nevyžaduje biol. mat. od probanda - spolehlivost je 100% Volba metod: PCR, PCR/RE, ASO, ARMS,... Southern blot, Northern blot, klonování, SSCP, DGGE, TGGE, heteroduplexová analýza, sekvenování…

PŘÍMÁ DNA DIAGNOSTIKA SRPKOVITÁ ANEMIE RE: Mst II – CCTNAG (N = A, C, G, T) Beta A globin: -- CCT-GAG-GAG -- -- GGA-CTC-CTC -- Beta S globin: -- CCT-GTG-GAG -- -- GGA-CAC-CTC --

NEPŘÍMÁ DNA DIAGNOSTIKA - nehledá se kauzální mutace - sleduje se segregace mutované alely pomocí vysoce polymorfních lokusů musí být jasná klinická diagnóza vyžaduje biologický materiál od probanda spolehlivost závisí na frekvenci rekombinace polymorfizmy: RFLP ( restriction fragment lenght polymorphism) VNTR ( variable number of tandem repeats) STR ( short tandem repeats)

RFLP - RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM POLYMORFIZMUS DÉLKY RESTRIKČNÍCH FRAGMENTŮ

RFLP

RFLP

VNTR – VARIABLE NUMBER TANDEM REPEAT GCTTTACCATTGGTAAAACTGA sekvence jednoho úseku možný počet tandemově se opakujících úseků: 1 - 7 frekvence jednotlivých alel: 1 (0.1), 2 (0.1), 3 (0.1), 4 (0.3), 5 (0.3), 6 (0.05), 7 (0.05)

STR SHORT TANDEM REPEAT A F CACACACACACACACACA 1 0.05 2 0.1 3 0.2 4 0.2 5 0.2 6 0.1 7 0.07 8 0.04 9 0.04

FIX gen FVIII gen Extragenové markery (proximální konec genu) Intragenové markery FIX gen Extragenové markery (distální konec genu) Extragenové markery (proximální konec genu) Intragenové markery FVIII gen Extragenové markery (distální konec genu)

1 2 I. 2 F*1 2 1 F2 1 1 F1 1 1 2 3 4 5 6 II. 1 F2 1 1 F1 1 1 F1 2 2 F*1 2 1 F 1 1 2 F2 1 2 F*1 2 1 F1 1 2 F2 2 1 2 3 4 5 6 7 III. 1 F1 1 1 F 1 2 1 F1 1 2 F2 1 2 F*1 2 2 F2 1 2 F*1 2 1 F1 1 2 F2 2 2 F*1 2 2 F2 2

FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ SPOLEHLIVOST MOLEKULÁRNĚ GENETICKÉ DIAGNOSTIKY nesprávná klinická diagnóza technické chyby záměna vzorků odběr mateřské tkáně místo fetálního, kontaminace chybná interpretace výsledků nedostatek biologického materiálu neinformativita rodiny non-paternita rekombinace mezi mutací a sledovaným markerem gonadální mozaicizmus