Praktické cvičení č. 3 ZÁKLADY GENOVÉHO INŽENÝRSTVÍ Klonování PCR produktu do vektoru PCR®2.1-TOPO® a transformace do E. coli AMOLc Úvod do molekulární biologie a genetiky - cvičení Jaro 2011 Biologický ústav Lékařská fakulta Masarykova univerzita Kamenice 5, 625 00 Brno

Genové inženýrství vytváření rekombinantních molekul DNA představujících pozměněné nebo nové geny nebo nové kombinace genů a jejich zavádění do genomů organizmů s cílem pozměnit jejich vlastnosti; metodickým základem genového inženýrství jsou manipulace s DNA in vitro založené na přípravě rekombinantních molekul DNA a jejich klonování Klonování DNA A) vytváření klonů DNA vložením segmentu DNA do klonovacího vektoru za vzniku rekombinantní molekuly DNA a její následné pomnožení v hostitelském organizmu B) vytváření klonů DNA pomnožením specifického segmentu DNA polymerázovou řetězovou reakcí Rekombinantní DNA DNA vzniklá spojením molekul DNA různého původu nebo jejich fragmentů in vitro

Klonování genů Příprava rekombinantní DNA Vnesení rekombinantní DNA do hostitelské buňky Namnožení bakterií s požadovanou sekvencí DNA v selekčním prostředí Izolace požadované DNA

Restrikční štěpení Endonukláza - enzym katalyzující hydrolýzu fosfodiesterových vazeb uvnitř polynukleotidového řetězce za vzniku oligonukleotidových fragmentů Restrikční endonukláza - sekvenčně specifická endonukláza, která štěpí ds DNA ve specifických sekvencích vytvářením dvouřetězcových zlomů

Rekombinantní DNA

Příprava rekombinantní DNA DNA ligáza - enzym katalyzující ligaci polynukleotidů, tj. vytvoření fosfodiesterové vazby mezi 5´-koncem a 3´-koncem polynukleotidových řetězců nebo jejich fragmentů

EcoR I ….. G A A T T C ….. ….. C T T A A G …..

Vektory Klonovací vektor - replikon použitý k zavedení cizorodé DNA do buňky Expresní vektor - klonovací vektor obsahující regulační sekvence umožňující expresi do něj vloženého cizorodého genu (cizorodé DNA) PLAZMID BAKTERIOFÁG KOSMID BAC - umělý bakteriální chromozom YAC - umělý kvasinkový chromozom

Přenos rekombinantní DNA do hostitelské buňky plazmid fragment DNA + = TRANSDUKCE TRANSFORMACE kompetentní RECIPIENTNÍ buňka

2. Selekční marker (rezistence k antibiotiku) MCS 1. Počátek replikace 2. Selekční marker (rezistence k antibiotiku) 3. MCS - mnohočetné klonovací místo (multiple cloning site, polylinker) - krátká sekvence DNA ve vektoru obsahující větší počet restrikčních míst, do nichž se vkládá cizorodá DNA

Komerčně dostupný vektor pCR®2.1-TOPO a princip TOPO klonování (Invitrogen)

Klonují se PCR produkty mající A přesah amplifikované Taq polymerázou (nespecifická transferázová aktivita) Linearizovaný vektor má na 3´- koncích přesah T Topoizomeráza se váže na specifickou sekvenci DNA 5´-CCCTT-3´a štěpí za ní fospodiesterovou vazbu, OH-skupina na 5´- konci PCR produktu reaguje s topoizomerázou a reakce probíhá v opačném směru = PCR produkt se liguje do vektoru a topoizomeráza se uvolňuje

Screening bakteriálních kolonií obsahující požadovanou sekvenci DNA fragment genu lacZa, který kóduje část enzymu -galaktozidázy, obsahuje vektor chromosom hostitelské bakterie obsahuje fragment  kombinací těchto fragmentů vzniká aktivní -galaktozidáza aktivitu tohoto enzymu lze detegovat přidáním derepresoru lac-promotoru (IPTG) do media dosáhneme exprese fragmentu genu lacZa z vektoru a + W a-KOMPLEMENTACE a + W W-část b-galaktozidázy a-část b-galaktozidázy + VZNIKÁ FUNKČNÍ b-GALAKTOZIDÁZA

X-gal Modrý produkt -galaktozidáza V případě přítomnosti chromogenního substrátu (X-gal) v mediu, je tato bezbarvá látka aktivitou -galaktozidázy přeměněna na barevný produkt = pokud do vektoru NEBYL vnesen inzert, a-část spolu s W-částí vytváří funkční b-galaktozidázu, která přeměňuje X-gal na modrý produkt = KOLONIE JSOU MODRÉ = pokud vektor obsahuje inzert, a-část je nefunkční, a tudíž nevzniká aktivní b-galaktozidáza = KOLONIE JSOU BÍLÉ IPTG, X-gal, antibiotikum X-gal -galaktozidáza Modrý produkt Detekce modrých a bílých kolonií

Klonování PCR produktu Voda pro mol. biologii Komerčně dostupný klonovací vektor pCR® 2.1-TOPO PCR produkt 2 µl 0,3 µl podle tabulky připravíme reakci a inkubujeme 5 minut při lab. teplotě poté inkubujeme 2 minuty na ledu následuje transformace vzniklého konstruktu (ligační směsi)

Příprava ploten pro transformaci budeme mít k dispozici agarové plotny obsahující ampicilin (100 µg/ml) na povrch agarových ploten rozetřeme hokejkou 50 µl roztoku IPTG (6 mg/ml) a 50 µl roztoku X-gal (4 mg/ml) po 30 min jsou misky připraveny k vysetí transformačních směsí

Transformace vzniklého konstruktu do buněk E. coli do zkumavky s ligační směsí umístěné na ledu přidáme 50 µl kompetentních buněk (= schopných přijmout cizorodou DNA) paralelní kontrolní zkumavka bude obsahovat 50 µl kompetentních buněk a 1 µl cirkulárního plazmidu pCR® 2.1-TOPO obě zkumavky inkubujeme 20 minut na ledu a poté je podrobíme teplotnímu šoku ve vodní lázni  42 °C po dobu 60 sekund znovu inkubujeme na ledu po dobu 10 minut a vysejeme na agarové plotny s ampicilinem, IPTG a X-gal agarové plotny umístíme do termostatu při 37 °C, druhý den pozorujeme kolonie

Kontakt na učitele: Marie Zobaníková mzobanik@med.muni.cz Praktické cvičení č. 3 ZÁKLADY GENOVÉHO INŽENÝRSTVÍ Klonování PCR produktu do vektoru PCR®2.1-TOPO® a transformace do E. coli AMOLc Úvod do molekulární biologie a genetiky - cvičení Jaro 2011 Kontakt na učitele: Marie Zobaníková mzobanik@med.muni.cz