Co se děje v sinkové buňce ?? Metabolizmus sinku Nobel, 1991 Co se děje v sinkové buňce ?? Na čem závisí síla sinku ? Jsou zde transportní procesy, které ovlivňují chování sinkové buňky?? Regulace související s transportními ději ?? Vztah zdroj - sink ?

Charakteristika sinku Metabolizmus sinku Charakteristika sinku Síla sinku = aktivita sinku x velikost sinku Aktivita sinku závislá na : využití asimilátů pro potřeby růstu a vývoje Metabolické sinky: apex, mladé, vyvíjející se listy, kořeny, vytvářející se plody, zásobní orgány Skladovací sinky: semena, hlízy, cibulky, skladovací kořeny, stonky, řapíky … Aktivita sinku závislá na :syntéze skladovacích látek – škrob, lipidy, proteiny U vyšších rostlin jsou sacharózasyntáza (SuSy) a invertázy klíčové enzymy regulace rozdělování sacharidů  určují sílu sinku Metabolické sinky: převážně invertázy Skladovací sinky: převážně SuSy

Regulace aktivity sacharózasyntázy (SuSy) Metabolizmus sinku Regulace aktivity sacharózasyntázy (SuSy) Degradace sacharózy Syntéza sacharózy Exprese relativně vysoká Exprese v sinku Exprese ve zdroji Exprese relativně nízká Protein akumulovaný v etiolovaných listech degradován na světle během deetiolizace X fotosyntetické enzymy a SPS Prudký pokles při tranzici sink- zdroj v listu V CC/SE komplexu – produkce energie pro dotování transportu ?? Produkce ADPG ..Syntéza škrobu ?? Několik genů s různou expresí (Arabidopsis 6 genů) – rozdíly v inhibici fruktózou Volná a asociovaná s membránou (účast na syntéze buněčné stěny) Př.: Transgenní brambor se sníženou expresí SuSy – snížení obsahu škrobu a snížení výnosu hlíz Př.: overexprese SuSy u tabáku pod 35S promotorem --- zvýšení celkové biomasy

Regulace aktivity invertáz Metabolizmus sinku Regulace aktivity invertáz Velmi složitý systém regulace …. Důležitá funkce Regulace na transkripční a post-translační úrovni Problém .. Množství individuálních invertázových genů, které jsou různě regulovány. Všechny dosud studované rostliny mají 2 vakuolární invertázy ( VI) a několik stěnových invertáz (WI) (6 u Arabidopsis, 9 rýže). Regulace exprese závislá na pletivu Regulace hormony (ABA, GA  aktivitu) Regulace cukry : většina indukovatelná sacharidy některé cukry reprimovatelné Posttranslační regulace Regulace kinázami/fosfatázami (jak WI, VI), ale různé kinázy s různým regulačním potenciálem, interagující s ABA a cukernou signalizací a interakcí s patogeny. Proteinové inhibitory – tvorba nefunkčního komplexu Kompartmentace vakuolární invertázy do PPV (Precursor Protease Vesicles)

Regulace aktivity vakuolární invertázy Metabolizmus sinku Regulace aktivity vakuolární invertázy Buněčná stěna plazmatická membrána jádro WAK 2 PPV invertáza VPE- proteáza aktivovatelná nízkým pH WAK: Wall-Associated Kinase Kompartmentace vakuolární invertázy do PPV (Precursor Protease Vesicles, ER odvozené), následná fúze s tonoplastem, obsah vstupuje do vakuoly. Akce invertázy, postupná degradace nízkým pH aktivovanou proteázou – puls aktivity invertázy. WAK2 ovlivňuje aktivitu vakuolární invertázy (nikoli stěnové), senzor turgoru, doména s kinázovou aktivitou v cytosolu. 22 členná WAK rodina u Arabidopsis. Huang et al., 2007

! Syntéza škrobu ve zdroji a sinku 8 Metabolizmus sinku Syntéza škrobu ve zdroji a sinku Cytosolická ADPGaza ??? Sacharóza zdroj sink Je SuSy schopná produkovat ADPG, co to znamená ??? Trióza-P Pi ATP ječmen – výjimka ?? chloroplast amyloplast hexózy Pi ADP Trióza-P G-6-P Trióza-P Trióza-P/ Pitranslokátor G-6-P ATP/ADP translokátor G-1-P ADP-G/ADP transportér G-1-P Pi G-1-P Sacharóza SuSy?? ATP ATP G-6-P/Pi translokátor SuSy?? ADP-G ADP-G ADP-G !  exprese v hlízách  snížení výnosu, prorůstání úžlab. pupenů, předčasné kvetení  exprese ADPGázy v hlízách  zvýšení obsahu škrobu v hlízách ADP-G Některé rostliny dvě formy ADPGázy (SuSy??)  exprese ADPGázy  špatný růst rostlin (nedostatek sacharózy pro rostoucí b.) Škrob Škrob ADP ADP Sacharóza Regulace syntézy : krátkodobá – allosterická inhibice/aktivace dlouhodobá – vývojové změny v expresi enzymů Transgenní rostliny : Martin  Ludewig, 2007 Bahaji et al., 2011

Invertáza SuSy Metabolizmus sinku G-6-P  G-1-P irreverzibilní reakce ?? PGM Poháněč syntézy škrobu ?? ? G-1P + ATP  ADPG + PPi PPi2Pi Arabidopsis typically partitions 30–50% of its photoassimilates into starch ? PGM PPáza další poháněč syntézy škrobu ?? Lytovchenko et al., 2007 Fetke et al., 2011

Příjem sacharózy endocytózou Metabolizmus sinku Příjem sacharózy endocytózou Baroja-Fernandez et al., 2006 Endocytické inhibitory : sníží syntézu škrobu sníží hladinu ADPG, UDPG neovlivní hladinu hexóza-P Žádný konflikt s transportem pomocí transportérů Žádný efekt inhibitorů při zásobování glukózou Acer pseudoplatanus (buněčné suspenze), disky hlíz bramboru, vyvíjející se endosperm ječmene Představa : počáteční fáze transportu (začátek dne) -- transportéry „vrcholná“ fáze transportu --- endocytóza

Metabolizmus sacharidů ve skladovacím sinku Metabolizmus sinku Model čtyř hlavních „futile cycles „ amyloplast vakuola cytosol apoplast Vykládání v plodech rajčete: 1.fáze :rychlý růst, sacharóza vykládána převážně symplastem, SuSy , degradace a resyntéza sacharózy (SuSy, SPS). (Veškerá import. sacharóza rozštěpena během 2 h). Vysoká akumulace škrobu, čistá akumulace škrobu 2.fáze :zpomalení růstu, sacharóza vykládána přes apoplast, degradace apoplastickou invertázou, resyntéza sacharózy v cytosolu, syntéza a degradace škrobu, čistá degradace škrobu Rychlost degradace škrobu konstantní, změna rychlosti syntézy  změna čisté akumulace Kontrolní body: Aktivita ADPGázy Rychlost transportu G-6-P mezi amyloplastem a cytosolem hydrolýza S v apoplastu, transport hexóz do cytosolu a resyntéza sacharózy kontinuální degradace S působením SuSy a resyntéza pomocí SuSy nebo SPS v cytosolu ??? Účel takto složitých vztahů ?? Efektivní kontrola hladin důležitých meziproduktů G-1-P; G-6-P; F-6-P; F,G, S Tím : regulace syntézy buněčné stěny, respirace, syntézy škrobu, skladování sacharózy, regulace osmotických poměrů hydrolýza S ve vakuole invertázou, transport hexóz do cytosolu a resyntéza sacharózy rychlá syntéza a degradace škrobu Futile = marný, zbytečný, neplodný, jalový Nguyen a Foyer, 2001

Když se sink stane zdrojem … Metabolizmus sinku Když se sink stane zdrojem … Srovnání degradace škrobu v listech, v dělohách klíčních rostlin a endospermu klíčících obilnin. Listy : Degradace v chloroplastu, maltóza jako hlavní transportovaný sacharid do cytosolu. Dělohy klíčních rostlin: Amyloplastová membrána je rozrušena, škrob je degradován cytosolickými enzymy. Glukanfosforyláza je důležitá při degradaci rozpustných glukanů. Sacharóza je syntetizována z degradovaného škrobu a transportována do kořenů a nadzemních částí semenáčků Endosperm obilnin: Jak plastidová membrána, tak plazmalema jsou rozrušeny, škrob je degradován v neživých pletivech. Škrobová zrna jsou atakována -amylázou přeměněna na maltózu a glukózu. Glukóza a maltóza jsou exportovány z endospermu do štítku, a pak konvertovány na sacharózu, která podporuje růst embrya. Smith et al., 2005

Koncepce zdroje a sinku Zdroj X sink Koncepce zdroje a sinku Zdroj: místo syntézy asimilátů Sink: místo utilizace Obecně: tok asimilátů od zdroje k sinku Zdroj: udává intenzitu transportu Sink: udává směr transportu Definovat pomocí: nabídka X poptávka Kombinace :fotoautotrofního, mixotrofního a heterotrofního způsobu výživy Jednoduchý vztah – klíční rostlina zdroj: dělohy sink: zejména kořen Situace se stává složitější s růstem a vývojem rostliny V čase dochází ke změnám Zdroj  Sink…….. zakládání nových sinků, vyhasínání zdrojů….. Změna zdroj sink v rámci jednoho listu Neustálé znovuustavování rovnováhy zejména mezi syntézou asimilátů, spotřebou ve zdrojové buňce, transportem a utilizací v sincích X

Př.: Změna zdroj – sink během vývoje bramboru Zdroj X sink Př.: Změna zdroj – sink během vývoje bramboru sink sink sink zdroj zdroj sink sink zdroj O morfologické změny, ale změny v genové expresi, proteinovém spektru, enzymatických aktivitách Př.: Změny sink - zdroj během vývoje listu cukrovka – změny listu sink-zdroj asi při 40-50 % listové expanze exportující list SPS importující list 0 SPS markery tranzice zdroj X sink Př.: Panašované listy – oblasti „zdrojové“ X oblasti „sinkové“ v jedné listové čepeli

 Regulace síly sinku cytokininem se liší v nadzemní části a kořenech Ovlivnění vztahů zdroj – sink Řízení síly sinku – komplexní záležitost  vývojové signály (kvetení, tvorba zásobních orgánů.. )  signály o změnách prostředí (zastínění, nedostatek živin, abiotický i biotický stres) …… prostřednictvím hormonů (auxin, cytokininy, ABA, GA), signálních molekul, změn turgoru Ovlivnění fytohormony Přímé ovlivnění : např. nakládání do floému: stimulace exogenním auxinem, inhibice exogenní ABA; opačný vliv exogenní aplikace na příjem v sinku Nepřímé ovlivnění : ovlivnění zakládání a růstu nových sinků. ovlivnění senescence, vývoje. Př.: Ovlivnění síly sinku u cytokinin-deficientních rostlin Nadzemní část :  obsahu chlorofylu, Ne - ovlivnění fotosyntetické kapacity a účinnosti, obsahu sacharidů  síla zdroje nebyla ovlivněna. ALE sinková pletiva   snížení obsahu NS sacharidů  aktivity vakuolární invertázy  obsahu ATP  silné ovlivnění síly sinku Kořeny: mírné  NS sacharidů, ALE :  ovlivnění glykolýzy, obsahu ATP, a vývoje kořenů  Regulace síly sinku cytokininem se liší v nadzemní části a kořenech

Př.: zastínění listů, cukrovka, fazole 16 Zdroj X sink Př.: odstranění plodů - změna alokace – často snížení rychlosti transportu – snížení rychlosti fotosyntézy Př.: zastínění listů, cukrovka, fazole Dlouhodobé změny Krátkodobé změny Zastavení růstu kořenů, přednostní zásobení mladých listů  rychlosti fotosyntézy,  aktivity RUBISCO,  snížení obsahu škrobu,  zvýšení obsahu sacharózy,  transportu z listu, obnovení růstu kořenů. Př.: Celer: primární produkty fotosyntézy: sacharóza a manitol utilizace sacharóza sacharóza, manitol velmi mladý list rostoucí list dospělý list syntéza 0 sacharóza sacharóza sacharóza manitol

Metabolizmus manitolu – ovlivnění stresem Metabolizmus sinku - Salinita , osmotický stres, nízká konc. Pi, vysoký obsah cukrů MTD + Napadení patogenem, vysoký obsah Pi, nízký obsah cukrů manitol + NAD  manóza + NADH +H+ manóza + ATP  manóza-6-P + ADP manóza-6-P fruktóza-6-P manitoldehydrogenáza (MTD) hexokináza (HXK) fosfomanózaizomeráza  osmotický stres

Př.: Jabloň (ale i jiné dřeviny) sink X zdroj spolupráce zdrojů X kompetice sinků zdroje sink 1 sink 2 sink 3 ……… Fitnes rostliny O alokaci rozhoduje relativní síla sinku vykládání z floému kompartmentaci metabolické aktivitě Závisí na účinnosti : apoplast: symplast metabolizmus v apoplastu Př.: Rozdělování asimilátů mezi sinky – ovlivnění výnosu - šlechtění bramboru : divoký typ: hlízy 7 % z celkové sušiny rostliny kulturní : 80% -„- Rozdělování mezi sinky výnosové parametry Př.: Jabloň (ale i jiné dřeviny) jaro léto podzim růst listů Zakládání pupenů opylení růst kořenů oplození růst výhonů Růst plodů kompetice  Bujný růst plodů vede k omezení vývoje plodů následující rok X

Mechanismy podobné kompetici mezi geneticky totožnými částmi rostliny Solidago canadensis (Zlatobýl kanadský)  Zastíněná část exportuje živiny (např. N) do části, která je může lépe využít

Př.: Betula pubescens !!! Propojení dvou rostlin houbovými hyfami při mykorhize………..živiny ze zastíněné rostliny osvětlená rostlina stejného (nebo jiného) druhu nezískává Prýt X reprodukční struktury Komporomis Růst prýtu… kompetice s ostatními rostlinami o světlo Krátkostébalné obilniny, + herbicidy potlačující konkurenční plevele Investice do reprodukčních struktur ….. množitelský potenciál  Mechanismy, které v celku zvyšují životaschopnost (fitness) rostliny

Schema vlivu rhizobialní a AM symbiózy na fotosyntézu Voda, teplota, světlo, živiny CO2, Fotosyntéza Pool asimilátů Stimulace živinami Stimulace sinkem Náklady na růst semen Náklady na růst rhizobií Koncentrace N Náklady na růst prýtu Náklady na růst AM Koncentrace P Náklady na růst kořenů  Rychlost fotosyntézy luskovin inokulovaných rhizobiálními a/nebo AM symbionty vzrostla oproti neinokulovaným rostlinám o 28% (rhizobiální), 14% (AM) a 51 % (kombinovananá inokulace)

??? Koordinace zásobování sacharidem a růstu rostliny X Koordinace růstu Koordinace zásobování sacharidem a růstu rostliny X dostupnost zdroje C a energie během celého cyklu den-noc (mobilizace škrobu nebo jiných zásobních látek) Asimilace C jen na světle Jak toho dosáhnout Rovnováha mezi: asimilací C  skladováním  růstem ??? Pravděpodobná centrální role cukerné signalizace Utilizace C se neřídí jednoduše momentálním přísunem asimilovaného C - „předvídání spotřeby během noci“  nutnost existence mechanismů řídících rychlost syntézy škrobu Degradace škrobu během noci se děje lineárně, rychlostí „předvídající délku noci“  nutnost „měřit“ množství škrobu na konci dne Změny podmínek prostředí vedou k „vyladění“ asimilace, skladování a spotřeby  nutnost vnímání změn a přizpůsobení metabolizmu

Syntéza a mobilizace škrobu Koordinace růstu Syntéza a mobilizace škrobu 12 h den noc 6 h 18 h den noc Arabidopsis thaliana schopnost regulace až do 4 h fotoperiody Rostliny při režimu 12/12  malé změny v obsahu cukrů i růstu během denního cyklu Změna délky dne   změna rozdělování mezi škrob a rozpustné sacharidy ve dne  změna rychlosti mobilizace během noci Př.: sója : 14 h fotoperioda … 60 % asimilátů  škrob 7h -“- 90 % -“- Rychle rostoucí genotypy Arabidopsis thaliana „více riskují“ – méně skladují a více získaného C investují do růstu Smith & Stitt, 2007; Stitt and Zeman, 2012

Co se stane, když experimentálně náhle prodloužíme délku noci ? 24 Koordinace růstu 3 Co se stane, když experimentálně náhle prodloužíme délku noci ? Syntéza škrobu a mobilizace škrobu Dojde ke kompletnímu zastavení růstu, zejména kořenů 4h den noc Zastavení růstu trvá několik hodin po opětném vystavení světlu Pokud tento režim trvá déle, dojde k ustavení nového rytmu syntézy škrobu a jeho utilizace v noci. 12h 12h Akutní odpověď: Náhlá změna; zastavení růstu Aklimační odpověď: Trvání změny ; vyladění rovnováhy mezi investicí do škrobu a mobilizací škrobu; obnovení růstu (s nižší rychlostí) Podobné přizpůsobení - reakce na sezónních změny, změny ozářenosti, teploty, dostupnosti vody…

 výrazně vyšší celková biomasa rostliny Důsledky rozdílného podílu investice do růstu rostliny RGR - relativní růstová rychlost – zvýšení biomasy/ jednotku existující biomasy za den Dlouhodobější perspektiva  mírně větší investice do růstu  výrazně vyšší celková biomasa rostliny Stitt and Zeeman, 2012

Genová exprese při nedostatku C Koordinace růstu 4 Genová exprese při nedostatku C Většina těchto genů vykazuje denní rytmus transkripce --- jakási příprava na nebezpečí nedostatku cukrů. Famine genes !!! Tato změna v trankriptech nevede ke změně hladiny enzymů Prodloužení noci vede ke změně transkripce během 4-6 hod, změny v aktivitě enzymů vyžadují několik dní. Vztahy mezi hladinami transkriptů a proteinů. 12 h/12h 6 h/18h Feast genes Jaké signály řídí denní změny v transkriptomu, a jak jsou spojeny s mechanismy koordinujícími C-stav a růst ?? Kandidáti : cirkadienní rytmus, světlo a cukry 30% genů vykazuje denní rytmus transkripce v růžici Arabidopsis.

Genová exprese při nedostatku C Koordinace růstu 4 Genová exprese při nedostatku C Většina těchto genů vykazuje denní rytmus transkripce --- jakási příprava na nebezpečí nedostatku cukrů. Famine genes !!! Tato změna v trankriptech nevede ke změně hladiny enzymů Prodloužení noci vede ke změně transkripce během 4-6 hod, změny v aktivitě enzymů vyžadují několik dní. Vztahy mezi hladinami transkriptů a proteinů. 12 h/12h 6 h/18h Feast genes Jaké signály řídí denní změny v transkriptomu, a jak jsou spojeny s mechanismy koordinujícími C-stav a růst ?? Kandidáti : cirkadienní rytmus, světlo a cukry 30% genů vykazuje denní rytmus transkripce v růžici Arabidopsis.

!!! Tato změna v trankriptech nevede ke změně hladiny enzymů Koordinace růstu 4 Famine genes Většina těchto genů vykazuje denní rytmus transkripce --- jakási příprava na nebezpečí nedostatku cukrů. !!! Tato změna v trankriptech nevede ke změně hladiny enzymů Prodloužení noci vede ke změně transkripce během 4-6 hod, změny v aktivitě enzymů vyžadují několik dní. Vztahy mezi hladinami transkriptů a proteinů. Feast genes 12 h/12h 6 h/18h Jaké signály řídí denní změny v transkriptomu, a jak jsou spojeny s mechanismy koordinujícími C-stav a růst ?? Kandidáti : cirkadienní rytmus, světlo a cukry 30% genů vykazuje denní rytmus transkripce v růžici Arabidopsis.

Přizpůsobení syntézy škrobu po epizodě vyčerpání C Nedostatek G-6 -P   SnRk1  dočasné zastavení růstu Ru-1,5 P2 Trióza-P Trióza-P Pi Fruktóza 1,6 bis-P Zvýšení obsahu cukrů, když je obnovena dostupnost C  syntéza T-6-P Fruktóza 6-P Fruktóza 6-P SH HS SnRK1 Glukóza 6-P Glukóza 1-P Glukóza 1-P ATP ADPGáza PPi UDP-Glukóza fosfatáza ADP-Glukóza TRX SPShigh SPSlow SnRK1 Sacharóza 6-P To je první Škrob Světlem indukovaná aktivace zprostředkovaná thioredoxinem Sacharóza T-6-P Cukrem indukovaná aktivace zprostředkovaná thioredoxinem (přes T-6-P) T-6-P cytosol chloroplast

Regulace redox stavem Aktivita ADPGazy SH HS Aktivita  Redukce Oxidace Lokalizace transportérů soustředěná do lipidických „raft-like„ domén. Zvýšení interakce protein-protein Aktivita transportérů Aktivita  Oxidace

Regulace při nástupu reproduktivní fáze Koordinace růstu Regulace při nástupu reproduktivní fáze Náhlá epizoda sucha nebo teplotního stresu  aborce semen v časném stadiu vývoje 1 den tmy ! reakce na C hladovění, nikoli přímá reakce na stres samotný- předcházení nesplnitelným nárokům na přísun C při dalším vývoji semene semena založená „před stresem“ a „po stresu“ normálně pokračují ve vývoji Integrace dalších podnětů Síť interakcí je v reálu složitější: zahrnuje reakce na další podněty, jako je např. dostupnost živin nebo různá odpověď částí rostliny např. na signály o kvalitě světla Zahrnuje signalizaci mezi jednotlivými částmi rostliny, a tedy možnost vzájemného vyladění jejich rekce na změnu podmínek prostředí Předpoklad : cukry jsou významnou komponentou této signalizační sítě