Nukleové kyseliny Organizace genomu David Kaftan, 2014

Nukleové kyseliny DNA, RNA, centrální dogma DNA RNA struktura Watson, Crick 1953, nobelova cena 1962 báze, nukleosidy, nukleotidy primární- komplementarita bazí sekundární- dvoušroubovice terciární replikace reparace mutace RNA struktura jednošroubovicová mRNA a hnRNA tRNA rRNA snRNA transkripce a úpravy RNA translace-proteiny

DNA a RNA jsou polymery purinových a pyrimidinových nukleotidů dlouhé, nerozvětvené polymery monomer – nukleotid purinová nebo pyrimidinová báze pentosový cukr fosfátová skupina DNA 2-deoxyribóza purin: adenine, guanine pyrimidin: cytosin, thymin RNA ribóza přítomnost 2‘ OH činí RNA méně stabilní pyrimidin: cytosine, uracyl

De-novo syntéza pyrimidinů CO2, kyselina asparagová, amidová skupina glutaminu kyselina orotová + fosforibosyl pyrofosfát (PRPP) uridine TP cytidin TP syntéza v plastidech UMP udržování nízké koncentrace, nebezpečí inkorporace do DNA dTMP dUMP + methenylhydrofolate metylace, deaminace dCDP (Lemna major)

De-novo syntéza purinů syntéza přímo z PRPP postupným přidáváním uhlíků glycin CO2 formyl a methenyl tetrahydrofolát (THF) amidové skupiny kyselina asparagová glutamin syntéza v cytosolu

Katabolismus a recyklace nukleotidů hydrolýza DNA, RNA oligonukleotidy mononukleotidy nukleosidy, báze syntéza jednostupňová reverzibilní v přítomnosti plastidové pyrofosfatázy dvoustupňová nereverzibilní báze + PRPP  ribonukleotid + PPi báze + (deoxy)ribóza 1-P  (deoxy)nukleosid + Pi (deoxy)nukleosid + ATP (deoxy)nukleotid + ATP

Nukleové kyseliny se skládají z řetězců nukleotidů kovalentní fosfodiesterová vazba fosfát s 5‘ a 3‘ uhlíkem nukleotidů dva funkční konce 3‘ volná hydroxylová skupina 5‘ volná fosfátová skupina

Párování bazí v DNA převládající forma DNA je dvouvláknová pravotočivá dvoušroubovice jedna otočka za 3.4 nm 10.1 párů bazí na otočku flexibilní vodíkové vazby mezi vlákny chybí vazby mezi „patry“ A – T dvě vodíkové vazby G – C tři vodíkové vazby párování hnáno zvýšením entropie vznik dvouvlákna snižuje entropii hydrofobní baze v centru vlákna stíněny od vody – zvýšení entropie

Alternativní struktury DNA B forma nejčastější A DNA dehydratovaná forma RNA-RNA, RNA-DNA šroubovice in vitro, ale i v buňkách Z DNA levotočivá šroubovice střídavé sekvence purinu a pyrimidinu, nejčastěji G, C

DNA v jádře je organizována v chromozómech DNA v lineárních chromozomech obsahujících proteiny histony malé proteiny s vysokým obsahem kladně nabitých aminokyselin lysinu a argininu vazba na negativně nabitou pentoso-fosfátovou kostru DNA nehistonové proteiny chromatin nukleosom dvě otáčky (166 bp) kolem oktameru histonových proteinů H2A, H2B, H3, H4 solenoid stabilizován histonem H1

replikace DNA je semikonzervativní

Replikace jaderné DNA iniciace, elongace, terminace S fáze buněčného cyklu iniciace zahájena na několika místech současně v místě bohatém na A, T (jen 2 vodíkové vazby) replikon celistvý segment DNA replikovaný z jednoho počátku 50-70 kb rychlost replikace baktérie 1000 nukleotidů za sekundu eukaryota 100 nukleotidů za sekundu ukončení replikace při setkání vidliček počátek obsahuje charakteristickou sekvenci kvasinky – 200 bp savci – počátky i 10 kbp od sebe rostliny – není známo

Replikace DNA: replikační počátky

Replikace jaderné DNA oddělení vláken DNA v oblasti bohaté na A, T vazba proteinů specifických pro replikaci DNA helikázy katalyzují při hydrolýze ATP rozplétání dvoušroubovice replikační protein A (RP-A) stabilizuje vlákno DNA DNA topoizomeráza rozplétá smyčky Primáza syntéza krátkých segmentů RNA komplementární s DNA DNA polymeráza připojení fosfátu fosfodiesterovou vazbou nového nukleotidu na 3‘ konec rostoucího řetězce nové DNA

DNA polymeráza připojení fosfátu fosfodiesterovou vazbou nového nukleotidu na 3‘ konec rostoucího řetězce nové DNA kondenzace poháněna hydrolýzou 2P nových dNTP nukleotidy jen na 3‘ konec nového řetězce podle 5‘-3‘ templátu roste DNA nespojitě Okazakiho fragmenty každý má svůj primer (asi 10 bazí) dodatečně pospojovány ligázou leading strand - kontinuálně rostoucí řetězec 1 primer lagging strand - nespojitě (diskontinuálně) rostoucí řetězec

DNA polymeráza připojování nukleotidů jen za primerem α , ε RNAza H 3‘ hydroxyl spojen vodíkovou vazbou s templátem DNA α nesyntetizuje dlouhé fragmenty 2 z jejích 4 podjednotek mají primázovou aktivitu postrádá exonukleázovou aktivitu , ε spojeno s PCNA dokončuje syntézu Okazakiho fragmentů RNAza H odstraňuje RNA primer záměnou za DNA ligáza spojuje 3‘ nového s 5‘ dalšího DNA fragmentu

RPA, PCNA replikační protein A (RPA) heterotrimerní struktura stabilizace jednovláknové DNA uvolněny Polα a Pol proliferating cell nuclear antigen (PCNA) homotrimerní struktura spojen s Pol a replikačním faktorem (Rfc)

DNA polymeráza: opravy chyb při replikaci připojení dalšího nukleotidu až po správném předchozím spárování frekvence chyb 1:107 bp polymeráza ve směru 5‘-3‘ nukleáza ve směru 3‘-5‘ proofreading nukleázová aktivita je hlavní příčinou nutnosti RNA primeru

DNA mismatch repair snižuje chybovost 1:107 zreplikovaných párů bazí o dva řády (1:109) rozeznání chyby vyštěpení chybné oblasti jedna baze celý úsek nemetylované DNA DNA polymeráza syntetizuje nový řetězec ligáza napojí fragmenty

Změny ve struktuře DNA spontánní depurinace deaminace cytosinu 100 bazí za den a genom thymidinový dimer - UV záření alkylace guaninu stabilita DNA závislá na účinnosti opravných mechanizmů většina změn v nekódujících sekvencích

Oprava pyrimidinových dimerů dimer indukováno UV světlem oprava potřebuje fotoreaktivaci UV-A světlem, aktivace fotoreceptorem fytochromem fotolyáza rozštěpí cyklobutanový dimer excision repair

Post-replikační oprava DNA polymeráza přeruší replikaci před poškozeným úsekem pokračuje až od dalšího místa s primerem (i několik stovek bp downstream) homologní rekombinace s komplementárním vláknem vyplnění chybějících částí DNA polymerázami napojení segmentů ligázami

Homologní rekombince opravy – uchování nezměněné DNA meióza – zdroj variability nové kombinace DNA nové geny, RNA, proteiny odlišné gamety mezi dlouhými sekvencemi podobných oligonukleotidů poměrně časté reciproké vs. genová konverze

Homologní rekombinace: single-strand annealing extrachromozomální plazmidová DNA T-DNA přerušení obou vláken obou duplexů exonukleázy odstraní nukleotidy a odhalí jednovláknový homologní úsek komplementární úseky jsou přiloženy (annealing) odstranění nehomologních částí oprava mezer nekonzervativní – jen jeden duplex přežije

Homologní rekombinace: double-strand break repair meióza přerušení dvou vláken jednoho z duplexů přerušení rozšířeno endonukleázami 3‘ přerušených vláken se vážou na komplementární úseky druhého duplexu kde slouží jako primery ostatní úseky opraveny konvenčními opravnými mechanizmy

Homologní rekombinace: přenos vlákna LIM15 (homolog RecA) synaptonemální komplex

Homologní rekombinace: one-sided invasion krátké (žádné) homologní sekvence u rostlin častější než ostatní typy rekombinace traspozonní elementy vmezeření T-DNA přerušení obou vláken akceptorového duplexu přerušení rozšířeno exonukleázami jeden z 3‘ konců invaduje komplementární vlákno intaktního duplexu prodloužení invadujícího vlákna

Telomery koncové sekvence chromozómů konzervované repetitivní sekvence telomeráza obsahuje RNA rozeznává terminální sekvenci bohatou na G opakovaně přidává repetitivní sekvence na konec telomery

Plastidy jsou endosymbionty DNA obsažena i v chloroplastech a mitochondriích

Plastidová DNA kruhový chromozóm rozdílné délky velký segment malý segment invertovaný opakující se segment chybí u některých bobovitých, jehličnanů a řas tandemové opakování rRNA Euglena gracilis rozdílné délky Codium - 89 kb Acetabularia - 400 kb vyšší rostliny obvykle 120-160 kb invertovaný segment: 0.5-76 kb

Plastidy obsahují vlastní i jaderné geny enzym rostliny řasy fotosyntetizující Epifagus Euglena Porphyra počet 101-150 40 82 182 Genetický systém rRNA rrn 4 3 tRNA trn 30-32 17 27 35 ribozomální protein rps rpl 20-21 5-6 15 2 21 46 18 Fotosyntéza Rubisco a další rbcLpsa psb pet atp 29-30 26 NADH dehydrogenáza nhd 11 Biosyntéza 1-5 1 počet intronů 18-21 6 155 kolem 100 genů většinou všechny rRNA, tRNA klíčové geny pro enzymy fotosyntézy nefotosyntetičtí rostlinní parazité ztratili většinu chloroplastových genů 50-73 kb, cca 40 genů řasy mají často více genů, které jsou u rostlin kódovány v jádře

Mechanismus replikace plastidové DNA mnoho kopií až 150 počet kolísá v závislosti na vývojovém stádiu frekvence replikace nezávislá na buněčném dělení u diferencujících se buněk synchronní u rychle dělících se buněk replikační počátky poblíž rRNA genů v invertovaných oblastech u tabáku pravděpodobně i další replikační počátky všechny enzymy potřebné pro replikaci plastidové DNA jsou kódovány v jádře helikázy, topoizomerázy, DNA polymerázy, primázy

Mitochondriální DNA velká variabilita velikostí Oenothera, Brassica: 200 kb Cucumis melo: 2600 kb rozsáhlé nekódující sekvence Arabidopsis kódující sekvence 10 % z 367 kb neobsahují opakující se sekvence živočišné mitochondrie mají malý kompaktní genom (16 kb) téměř bez nekódujících sekvencí lineární Chlamydomonas cirkulární jeden kruhový chromozom Marchantia, Brassica mnoho subgenomických kruhových chromozómů

Homologní rekombinace subgenomických chromozómů dynamika master cycle – subgenomic cycle rekombinace opakujících se sekvencích 2 isoformy 2 subgenomické cykly 3 kombinace subgenomických cyklů

Mitochondriální genom malý počet genů oxidativní respirace syntéza ATP translace

Přenos DNA z a do plastidů a mitochondrií promiskuitní DNA obsažena ve více kopiích jádro, mitochondrie, chloroplasty rostliny, živočichové, houby není jen jednosměrný transfer plastidy-jádro, jádro-plastidy plastidový ribozomální protein rpl23 nahrazen jaderným po inaktivaci původního plastidového chloroplasty špenátu obsahují původní rpl23 přenos z chloroplastu do mitochondrií jednosměrný mechanismus ochrany před vstupem cizí DNA

Transkripce DNA - geny gen protein DNA kód genom kódován DNA kóduje protein protein DNA - aminokyselina sekvence aminokyselin -protein trojrozměrná struktura určuje funkci DNA kód 4-písmenná abeceda (A,G,C,T) kódující část genu menší část nekódující část kdy a kolik proteinu se bude syntetizovat genom kompletní genetická informace DNA organismu

Organizace plastidového genomu operon sekvence bakteriálních genů podobného typu transkribovaných najednou polycistronní transktipt klastry dvou a více genů, mohou být i funkčně odlišné monocistronní transkript jeden transkript a jeden gen introny nekódující sekvence určené k vystřihnutí a degradaci exony kódující sekvence

Organizace jaderného genomu asi jen 1 % DNA je transkribováno počet genů podobný, ale velikost genomu velmi rozdílná gen promotor transkribovaná oblast exony introny 3‘ konec nesoucí regulační funkce

Organizace jaderného genomu příbuzné rostliny mají geny uspořádány podobně umístění na chromozómu odděleně v klastrech, často opakujících se histony: 10-600x rRNA:

Transposable elements mobilní DNA sekvence mohou tvořit podstatnou část jaderného genomu transposony retrotransposony

Bakteriální transposable elements vložené sekvence (insertion sequence elements) inverted repeat 5‘ GAGC-----GCTC 3‘ 3‘ CTCG-----CGAG 5‘ 1-2 kb mohou tvořit podstatnou část jaderného genomu přesun více méně náhodný přesun jen DNA poměrně vzácně 1:105-107 buněk

RNA: primární struktura lineární, nerozvětvený polymer nukleotidů adenin, guanin, citosin, uracyl fosforylovaná ribóza párování s DNA A-U, T-A, G-C, ale také G-U méně stabilní než DNA volný 2‘ hydroxyl ribózy heteropolární řetězec 5‘ začátek 3‘ konec častá katalytická aktivita váha – S sedimentační koeficient Svedberg

Sekundární struktura RNA většina tvořena jednotlivými vlákny lokální sekundární struktura smyčky, vlásenky výduť standardní párování G – C, A – U nestandardní párování G – U, U – U, G – A volný 2‘ hydroxyl ribózy poskytuje vodíkovou vazbu k interakcím interakce domén vytváří terciální struktury

RNA je méně stabilní než DNA 2‘ vodík deoxyribózy u DNA stabilní RNA nese na 2‘ ribózy hydroxylovou skupinu při neutrálním pH atakuje fosfodiesterovou vazbu

Prekurzorová a mediátorová RNA mRNA – messenger (mediátorová, informační) kóduje aminokyselinovou sekvenci proteinů (1-2% celkové buněčné RNA) nejméně stabilní hnRNA - heterogenní nukleová pre-mRNA - prekurzorová mRNA vzniklá v jádře, tzv. primární transkript delší než samotný strukturní gen různé oblasti DNA exony (kódujicí) introny (nekódujicí) působením ribonukleáz se upravuje na funkční mRNA

Transferová RNA tRNA – transferová (přenosová) mitochondrie přenos aktivované aminokyseliny z cytoplasmy na ribosom většina 4S RNA mitochondrie chybí většina celého setu import s cytoplazmy chloroplasty obvykle soběstačné paraziti importují z cytoplazmy cytoplazma

Ribosomální RNA rRNA – ribosomální součást ribozomu 3 typy ribozomů malá podjednotka velká podjednotka 3 typy ribozomů cytoplasmatické plastidové mitochondriální

malé RNA malé RNA účast na sestřihu pre-mRNA, DNA replikaci, transport RNA na ER snRNA – malá jaderná (nukleová) RNA RNA splicing: U1, U2 ,U4-9, U11, U12 úprava 3‘ histonové mRNA: U7 snoRNA – malé jadérkové RNA pre rRNA processing scRNA – malé cytoplasmatické RNA cRNA – chromosomová RNA miRNA – mikro RNA regulace a stabilita translace mRNA telomerázová RNA templát pro prodlužování telomer jaderných chromozomů 7SL RNA import sekretovaných proteinů do endoplazmatického retikula

Genetická informace kódovaná v RNA virus tabákové mozaiky jednovláknová RNA proteinový kabátek kódován RNA Gierer a Schramm 1956 samotná RNA způsobuje infekci Fraenkel-Conrat, Singer 1957 hybridní virové částice RNA a cizí protein nové virové částice obsaohvaly vlastní protein

Transkripce DNA na RNA syntéza od 5‘ směrem k 3‘ templátové vlákno DNA přepsáno do komplementárního vlákna RNA identické s komplementární DNA uracil místo thyminu RNA polymeráza se pohybuje po DNA ve směru od 3‘ k 5‘

RNA polymerázy RNA polymeráza se váže slabě k DNA podobná struktura bakteriálních a eukaryotních polymeráz

jaderná RNA polymeráza RNA polymeráza I jadérko 25S, 17S a 5.8S rRNA RNA polymeráza, II nukleoplasma mRNA, U1, U2, U4, U5 RNA polymeráza III nukleoplazma třída 1 5S rRNA třída 2 tRNA třída 3 U3, U6, další malé stabilní RNA

jaderná RNA polymeráza struktura dvě velké podjednotky (125 a 220 kDa) několik dalších malých podjednotek 5 z nich společné všem polymerázám 220 kDa podjednotka RNA polymerázy II C terminální doména YSPTSPS transkripční faktor II H (TFIIH) kináza fosforylující Ser, Thr uvolnění RNA polymerázy II s promotoru iniciace transkripce

chloroplastová RNA polymeráza kódovaná v jádře jeden protein bakteriofágový typ plastidová , , ‘ podjednotky kódovány v chloroplastu  v jádře spolupráce jaderného a chloroplastového genomu vazba na -10 a -35 consenzuální motiv promotoru

Iniciace transkripce promotor terminační sekvence jádro plastidy místa na chromozómu pro vazbu RNA polymerázy TATA box terminační sekvence jádro pro vazbu třeba transkripční faktory obvykle jeden promotor pro jeden gen plastidy vazba RNA polymerázy obvykle bez transkripčních faktorů geny a operony mohou mít mnoho promotorů podobně snad i u mitochondrií

DNA transkripce Proces podobný replikaci DNA RNA transkript je krátký transkript nezůstává spojen s DNA DNA dvojšroubovice se ihned obnovuje RNA transkript je krátký tisíce nukleotidů RNA-polymerázy mohou jít za sebou syntéza další RNA před dokončením prvního transkriptu rychlá tvorba mnoha transkriptů RNA-polymeráza nemá opravnou schopnost

Cytoplazmatická mRNA méně stabilní než tRNA a rRNA posttranskripční úpravy m7G čepička 5‘ konec mRNA připojení guanosinu N-7 metylace nezbytné pro iniciaci translace ochrana před degradací poly A 3‘ polyA polymeráza dosyntetizuje poly adeninový konec 20-250 A umožňuje export z jádra stabilizuje mRNA proti degradaci nezbytný pro iniciaci translace

Plastidová a mitochondriální mRNA jedna mRNA může nést několik kódujících sekvencí chybí 5‘ čepička i 3‘ poly A mitochondrie 5‘ TP plastidy 5‘ MP některé mají krátký polyA 3‘ konec podporuje degradaci 3‘ i 5‘ konce mohou tvořit smyčky regulační funkce úprava, translace, degradace

RNA processing exony introny RNA splicing kódující sekvence nekódující sekvence jaderná i plastidová, mitochondriální RNA žádné introny u 5.8S, 5S rRNA, snRNA délka jaderné savčí 100b-100kb obvykle 80-140 nukleotidů u rostlin, bohaté na A-U( 60-70%) v plastidech někdy chybí zcela RNA splicing před opuštěním jádra po přidání čepičky a poly(A) vystřihnutí intronů speciální sekvence několika nukleotidů určuje pozici 5´GU- AG 3 spojení exonů

Introny jaderné pre-mRNA <70 G:GU….AG:N jaderná mRNA délka místa střihu výskyt jaderné pre-mRNA <70 G:GU….AG:N jaderná mRNA jaderné pre-tRNA 11-13 nekonzervované jaderná tRNA skupina I >200 U:N….G:N plastidová tRNA, rRNA, mRNA skupina II <200 až >400 plastidy a mitochondrie skupina III Euglena obvykle nejsou kratší než 70 bazí bohaté na A-U páry dvouděložné 70% jednoděložné 60%, někdy ale jen 30%

Splicing intronů spliceosome lariat uvolněný intron se odbourá malé jaderné nukleoproteinové částice snRNP snRNA U1, U2, U4/U6 komplex, U5 non snRNP factors lariat guanosin na rozhraní intronu a exonu na 5‘ konci pre-mRNA vytvoří fosfodiesterovou vazbu s 2‘ hydroxylovou skupinu adenosinu uvolněný intron se odbourá introny zvyšují pravděpodobnost rekombinace exonů a tvorby nových proteinů. alternativní sestřih jeden gen dá vznik několika mRNA a různým proteinům

Splicing pre-tRNA introny krátké jen 11-60 bazí není konzervovaná sekvence střihu obsahují sekvenci komplementární k antikodonu endonukleáza odštěpí intron v blízkosti antikodónu cyklická fosfátová skupina rozštěpena na 2‘ fosfát 5‘ hydroxyl fosforylován RNA ligáza spojí oba konce fosfatáza odstraní 2‘ fosfát

Selfsplicing ribozym skupina I skupina II RNA s katalytickou aktivitou guanosin jako kofaktor skupina II podobný mechanizmus jako pre-tRNA adenosin intronu atakuje OH na 3‘ prvního exonu lariat nejsou přítomny u rostlinných mitochondrií a chloroplastů

Selfsplicing ribozym skupina I skupina II RNA s katalytickou aktivitou guanosin jako kofaktor skupina II podobný mechanizmus jako pre-tRNA adenosin intronu atakuje OH na 3‘ prvního exonu lariat nejsou přítomny u rostlinných mitochondrií a chloroplastů

Úprava rRNA většina genů transkribována jako prekurzorové RNA a poté upravována pouze některé malé RNA transkribované RNA polymerázou III nejsou upravovány 5S rRNA plastidové rRNA kódované v polycistronické transkripční jednotce obsahující dva geny tRNA s neobvykle dlouhým intronem

Úprava tRNA transkribovány RNA polymerázou III pre-tRNA obsahují nadbytečné sekvence na 3‘ i 5‘ konci odstraňovány nukleázami přidání CCA na 3‘ odstranění intronu

Úprava plastidové pre-mRNA chloroplastový genom obsahuje cca. 150 genů ale jen 60 transkripčních jednotek pre-mRNA polycistronický transkript štěpení na monocistronické mRNA nezbytné pro translaci bakteriální translace polycistronické mRNA mitochondrie transkribují monocistronické pre-mRNA kromě několika vyjímek

RNA editting změna sekvence kódující protein objeveno u mitochondrií trypanozomy změny nukleotidů přidání, odstranění poly U předány z 3‘ guide RNA mitochondrie Trypanozoma, Physarium modifikace, substituce C – U, méně často U – C plastidy, mitochondrie rostlin 1200x na genom v mitochondrii 30x na genom chloroplastu

Doba života RNA mRNA se může překládat několikrát podle množství potřebného proteinu se řídí doba života mRNA. prokaryota 3 min eukaryota 30min až 10 hodin.