Využití v systematické biologii Isoenzymová analýza Využití v systematické biologii

Základní termíny Isozymy -enzymy kódované v různých lokusech , vykazující stejnou nebo podobnou aktivitu. ) Alozymy -alelické formy téhož enzymu (kódované v jednom lokusu) Zymodem -taxonomická jednotka vymezená na podkladě isozymového vzoru Zymogram - rozložení zón a tedy i jednotlivých enzymů na elektroforetogramu

Princip metody Detekce elektroforetickou mobilitou se lišících forem enzymů kódovaných různými alelami určitého genu. Jednotlivé enzymy se detekují prostřednictvím jejich specifické aktivity, většinou pomocí spřažené enzymatické reakce s barevným produktem.

Příklad zymogramů Alozymová analýza Toxoplasma gondii 4

Věcný (biologický) podklad metody Velké množství genů pro enzymy je polymorfních (nejhojnější alela <90 %) Velká část tohoto polymorfismu představuje polymorfismus vnitropopulační (obvykle 15 % genů je polymorfních, od 0-50 %) (málo ptáci!) Alozymy se liší sekvencí aminokyselin, značná část změn se projeví změnami elektromobility.

Postup plánování pokusu (pilotní pokus) sběr a konzervace materiálu homogenizace elektroforéza detekce odečet zón na elektroforetogramu statistické vyhodnocení a biologická interpretace

Elektroforéza Sběr materiálu centrifugace homogenizace elekroforéza barvení Odečet zón

Elektroforéza

Detekce Glukozofosfát isomeráza Princip: Tetrazoliové soli jsou redukovány na modrý formazan Chromogenní substrát: methyl thiazolová modř(MTT) přenašeč elektronů: phenasin methosulfát (PMS) Glukozofosfát isomeráza GPI GPD glukonolakton-6-fosfát fruktozo-6-fosfát glukozo-6-fosfát PMS NADP NADPH NADP MTT formazan fruktozo-6-fosfát, NADP, MgCl2 ,MTT, PMS, glukozo-6-fosfát dehydrogenáza

Sledované rozdíly Fixované alely Rozdíly ve frekvenci jednotlivých alel

Hlavní výhody Kodominance Množství polymorfismu je vhodné pro vnitropopulační studie Znaková metoda Cena analýzy a cena vybavení

Limity metody Konvergence (i různé alozymy mohou mít shodnou elektromobilitu) když rozliším 5 poloh a dva druhy se liší ve 30 % pruhů, budou 2/3 shodných pruhů ve skutečnosti reprezentovat jiné alozymy Maximální divergence 60-70 % u žab na úrovni rodu či spíše druhů u savců na úrovni podčeledí

Hlavní oblasti využití Studium populační struktury rozmnožovací struktura (např. panmixie) vazebná nerovnováha migrace genetická příbuznost populací Studium druhové diversity kryptické (sibling) druhy (sym/alopatrické) determinace známých druhů Fylogeneze

Struktura populací V panmiktické populaci Hardy- Weinbergova rovnováha AA Aa aa np2 2np(1-p) n(1-p)2

Možné příčiny odchylek od H-W rovnováhy Wahlundův efekt kryptické druhy parthenogeneze strukturovanost populace asortativní rozmnožování Selekce

Způsob testování odchylek od H-W rovnováhy CHI2 test (slabý test, nevhodný pro kombinovaná data z více lokusů) Σ(Fpozorovaná-Fočekávaná)2/Fočekávaná Smithova H statistika (mnohem lepší) H=[(4n2p(1-p) - (2n-1)Nhet)]/4n(n-1) konfidenční intervaly: H ± Z0,05(p2(1-p)2)/(n-0,5) Z0,05=1,96 (N>60), Z0,05=2 (N=60) Z0,05=2,04 (N=30)

Příklad testování odchylek od H-W rovnováhy A1A1 A1A2 A2A2 n Pozorováno 40 35 25 100 Frekvence alely A1 (p) p = [(2 × 40) + 35]/ (2 × 100) = 0,575 Frekvence alely A2 (q) q = 1 – p = 0,425 A1A1 A1A2 A2A2 n Očekáváno 100 × p2 200 × pq 100 × q2 100 33,0 48,9 18,1 100 χ2 = (40 – 33,0)2 + (35 – 48,9)2 + (25 – 18,1)2 = 8,1 33,0 48,9 18,1 Df: 3 – 1= 2, P < 0,01

Příklad testování odchylek od H-W rovnováhy II A1A1 A1A2 A2A2 n Pozorováno 40 35 25 100 Frekvence alely A1 (p) p = [(2 × 40) + 35]/ (2 × 100) = 0,575 Frekvence alely A2 (q) q = 1 – p = 0,425 H=[(4n2p(1-p) - (2n-1)Nhet)]/4n(n-1) = = [4 × 1002 × 0,575 × 0,425 – (2 × 100 – 1) × 35] = 0,071 C.I.95 = H ± Z0,05(p2(1-p)2)/(n-0,5) C.I.95 = H ± 1,96(0,57 × 0,43)/(100 - 0,5) C.I.95 = 0,071 ± 0,0012 Nezahrnuje 0, je kladná: signifikantní nadbytek homozygotů)

Testování vazebné nerovnováhy Chi2

Testování rozdílů ve frekvenci alel Používá se Chi2 test Pozor: I na velkém souboru jedinců nejde mnohdy prokázat menší rozdíl ve frekvenci. Minimální velikost souboru je asi 50 jedinců, většinou potřeba stovek až tisíců jedinců. Nutný pilotní pokus.

Určování genetické vzdálenosti populací Rogersova vzdálenost R= (0,5 Σ(xi - yi)2)0,5 (1 lokus) Pro víc lokusů -aritm. průměr (xi, yi –frekvence i-té alely v jedné a druhé populaci) Neiovská vzdálenost D= -ln I , I= Σ xiyi/(Σ xi2 Σ yi2)0,5) Pro víc lokusů: I=Jxy /(JxJy)0,5 (Jxy, Jx a Jy jsou postupně aritm. průměry z Σ xiyi, Σ xi2 a Σ yi2 pro všechny lokusy) Mortonův příbuzenský koeficient KAB= ((xi-Pi)(yi-Pi))/Pi(1-Pi) (Pi: frekvence i-té alely v metapopulaci)

Problém s haploidními organismy Neexistují heterozygoti, nutno nahradit analýzou frekvence haplotypů Ab u jednoho typu, aB u druhého Nevýhoda: H-W rovnováha se ustavuje v jedné generaci, vazebná nerovnováha přetrvává mnoho generací poté, co již její příčina pominula.

Studium druhové diversity Kryptické druhy (liší se většinou 10 % fixovaných alel) když je frekvence alel mezi 30-70 % stačí poměrně malé N, např. 5 a 5 exemplářů, abychom prokázali podezřelou absenci heterozygotů Příklad: druh A: 3 kusy, druh B: 7 kusů, Nhet (teor) = = 2pq = 0,42; P=(1- 0,42)10 =0,5810 = 0,004 pozor na příbuzné dobré najít další znaky

Determinace organismů Pozor při využívání mimo původní areál Preference nedestruktivních metod Cena

Studium fylogeneze Vhodné: především fixovaný polymorfismus, méně vhodné: frekvence alel. Lze využít jak znakové tak distanční metody.

Závěry Alozymová analýza je technicky nenáročná metoda vhodná ke zpracovávání velkého počtu jedinců. Jedná se v principu o jednolokusovou metodu, lze jí však postupně studovat desítky lokusů. Není jisté, zda monitoruje selekčně neutrální znaky. Je spíše vhodná pro relativně příbuzné OTU.