Difuze Lékařská chemie a biochemie 2. ročník - zimní semestr © Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova v Praze a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze,

Difuze  limituje velikost buněk a jednobuněčných organismů  je hlavním způsobem výměny látek v buňce a do značné míry i mezi buňkou a jejím okolím (!O 2 )  je dostatečně rychlá a efektivní na vzdálenost  m (např. od povrchu b.), to omezuje velikost metabolicky aktivních bb. na  m  pro difuzi je limitujícím faktorem též plocha, na které probíhá (povrch b.) PRŮMĚR (  m)POVRCH (  m 2 )OBJEM (  m 3 ) POMĚR povrch/objem 13,145, ,0 32, , ,0 103, , ,6 302, , ,2 1003, , , , , , , , ,006 Poměr povrchu a objemu kulových bb v závislosti na jejich průměru Difuze 2014/20152

Živočišná buňka (schematicky) Difuze 2014/20153

STRUKTURA BUNĚČNÉHO JÁDRA -jádro eukaryotních bb je obklopeno dvěma fosfolipidovými membránami o vnitřní ohraničuje vlastní jádro o vnější je spojená s rozsáhlým cytoplazmatickým membránovým systémem s navázanými ribozomy (nazývaný jako hrubé nedoplaz. retikulum) o prostor mezi nimi je spojitý s lumen (vnitř. prostorem) nedoplaz. retikula o v některých místech jsou obě spojeny a vytvářejí tak jaderné póry (ty pravděpodobně slouží k regulaci pohybu různých materiálů mezi jádrem a CP) -chromozomy jsou v intervizi jen asi 25 nm tlusté a nejsou vidět ve světelném mikroskopu (jím vidíme v jádře jen jadérko obsahující oblast jednoho (či více) chromozomů, v anglosaské literatuře nazývanou nukleolární organizátor) o tato oblast řídí syntézu ribozomální RNA o v jadérku se k ribozomům připojují i některé rib. Proteiny o částečně či úplně hotové rr se pak dostávají jadernými póry do CP o přesná organizace a fungování buněk. jádra zatím nejsou známy -v intervizi slouží jádro hl. k řízení syntézy RNA -v proliferujících a diferencujících se bb je jádro vysoce metabolicky aktivní, v klidových („odpočívajících“) bb je inaktivní („spící“) a probíhá na něm jen nepatrná syntéza DNA a RNA -děje probíhající v jádře a buňce při dělení b jsou probírány v histologii a biologii, jejich chem. aspekty viz. 2. pol.semestru Difuze 2014/20154

BUNĚČNÝ MEMBRÁNOVÝ SYSTÉM A ORGANELY -dvouvrstva fosfolipidů obsahující proteiny, glykoprot. a glykolipidy v různém zastoupení může vytvářet řadu struktur s jedinečnou charakteristikou a funkcí -eukaryotické bb na rozdíl od prokaryotních obsahují rozsáhlý a složitý systém vnitřních membrán, který není propojen s plazmatickou membr. o tyto membrány uzavírají určité oblasti a oddělují je od zbytku CP – vytvářejí tak soubor různých podbuň. struktur, které nazýváme buněčné organely -mezi ně počítáme mitochondrie, hrubé a hl. endoplazm. Retikulum, Golgiho aparát, lysosomy, peroxisomy a různé menší vehikuly -u rostl. Bb jsou to navíc chloroplasty a vakuoly -každá organela hraje jedinečnou roli při růstu a metabolismu b a obsahuje tomu odpovídající soubor specifických enzymů, katalyzujících zde probíhající chemické reakce Difuze 2014/20155

Endoplazmatické retikulum -představuje vzájemně propojenou síť vnitřních membrán a je největší membránou eukaryotní b -má v b řadu fcí – k nejdůležitějším patří syntéza mnoha membr. proteinů a lipidů -podle toho, zda jsou na povrchu membrán navázány ribozomy rozeznáváme hrubé (s ribozomy) a hladké (bez nich) -hladké ER je místem syntézy a metabolismu mastných k. a fosfolipidů, nejvíce je ho v jaterních bb o obsahuje enzymy, které se účastní při modifikaci cizorodých látek (xenobiotik), mající usnadnit jejich vylučování z organismu (detoxikační fce); u experimentálních zvířat, kterým bylo podáváno větší množství cizorodých látek došlo ke zmnožení hl. ER v jater. Bb -hrubé ER je místem syntézy řady membránových a organelových bílkovin a také místem, kde vnikají bílk.,které mají být secernovány mimo b; tyto proteiny se hromadí v lumen (vnitř. prostoru) hrubého ER o největší množství se hr. ER je v bb specializovaných na sekreci proteinů – trávicí žlázy (pankreas) a bb produkující protilátky -(ribozomy se vyskytují i volně v CP – slouží k tvorbě cytosolových proteinů – enzymů, receptorů a cytoskeletu) Difuze 2014/20156

STRUKTURNÍ HYPOTÉZA SYNTÉZY MEMBRÁNOVÝCH A SEKREČNÍCH PROTEINŮ NA ENDOPLAZMATICKÉM RETIKULU -signální peptid se skládá z převážně hydrofobních (nepolárních) aminokyselin -u membránových proteinů se také odštěpuje, ale membr. protein zůstane zachycen v membráně svou hydrofobní oblastí -u sekrečních dojde k úplnému průniku do lumen endoplazmatického retikula Difuze 2014/20157

STRUKTURNÍ HYPOTÉZA SYNTÉZY MEMBRÁNOVÝCH A SEKREČNÍCH PROTEINŮ NA ENDOPLAZMATICKÉM RETIKULU Difuze 2014/20158

Golgiho komplex -představuje jakýsi „dopravní dispečink“ transportních systémů b, hraje klíčovou roli v třídění buněčných bílkovin a složek buněčných membrán a jejich odesílání na místo určení; k tomu je vybaven enzymy, které modifikují jednotlivé konstituanty procházející Golgiho komplexem na místo určení. -může zde dojít k navázání „značky“ ve formě sacharidu či fosfátu, která pomůže při dalším transportu na místo určení- -vstup se děje v cis oblasti, trans oblast je místem výstupu z Golgiho komplexu, v trans oblasti dochází k oddělování transportních vehikul (měchýřků), nazývaných také sekreční – tyto měchýřky v případě sekrece proteinů mimo b splývají s buněčnou membránou a tak dojde k exocytose – vylití obsahu sekrečních vesikul mimo b. Difuze 2014/20159

Malé vesikuly mohou také „převážet“ složky membrán z jedné organely na druhou (i když zatím neznáme přesný mechanismus transportu). Lysosomy -obsahují enzymy „kyselé hydrolázy“ pracující při pH okolo 5 a níže – tyto enzymy odbourávají biopolymery na jejich stavební složky (monomery) -při neutrálním pH tyto enzymy nepracují, aktivují se snížením pH uvnitř lysosomu pomocí „protonové pumpy“ ( H+ dependentní ATP-ázy) Peroxizomy -jsou malé, membránou ohraničené organely živočiš. Bb, podobají se lysosomům, ale mají jinou fci -obsahují enzymy, které odbourávají mastné k. a AMK (tedy spíše „monomery“ než polymery) -vedlejším produktem jejich činnosti je peroxid vodíku, který je pro b velmi nebezpečný; proto peroxizomy obsahují velké množství enzymu katalázy, která katalyzuje reakci 2 H 2 O 2 (+kataláza)  2 H 2 O + O 2 -přesný význam peroxizomů v metabolismu b je ještě stále ve stádiu experimentálního zkoumání Difuze 2014/201510

ODDĚLOVÁNÍ BUNĚČNÝCH SOUČÁSTÍ Difuze 2014/201511

Separace hrubého endoplazmatického retikula, Golgiho aparátu a plasmatických membrán centrifugací na hustotním gradientu Čistota frakcí se ověřuje elektronovou mikroskopií -čistota jednotlivých buněčných frakcí (organel) se zjišťuje pomocí elektronového mikroskopu (trvá déle) nebo pomocí enzymů, které jsou pro dané organely specifické -stanovuje aktivita specifických enzymů a podle její výše se usuzuje na čistotu izolovaných buněčných organel Difuze 2014/201512

MECHANISMY ENZYMOVÉ KATALÝZY 1)acidobazické - poskytnutí či přijetí protonu reaktantu, často se k tomu využívají ionizovatelné postr. řetězce AMK 2)kovalentní - nukleofilní napadení substrátu katalyzátorem, přechodně vzniká kovalentní vazba, následovaná elektrofilní stabilizací vznikajícího negativního náboje na komplexu přechodového stavu reakce - jako kovalentní katalyzátory mohou sloužit postranní řetězce a koenzymy 3)kovové ionty – katalyzují reakce tím, že stabilizují vznikající negativní náboje způsobem připomínajícím kyselou katalýzu -mohou být pevně vázány (metaloenzymy) – nejčastěji Fe 2+ i 3+, Cu 2+, Zn 2+, Mn 2+, Co 3+ (ale i řada dalších) -nebo mohou být volně vázány z roztoku (Na +, K +, Mg 2+, Ca 2+ ) a svou přítomností enzym aktivovat (bez nich je nefunkční) a. vazbou na substrát, aby byl vhodně orientován pro reakci b.zprostředkování redox reakce reverzibilními změnami kovového iontu v oxidovaném stavu c.elektrostatickou stabilizací nebo odstíněním negativních nábojů působí podobně jako proton (Lewisova kyselina), jsou však mnohem účinnější, protože mohou být přítomny ve vysoké koncentraci i při neutrálním pH a mohou mít náboj větší než 1+ („super kyseliny“); jejich přítomnost způsobuje, že na ně vázané molekuly H 2 O jsou kyselejší než volná H 2 O a jsou zdrojem –OH iontů – vzniklá hydroxylová skupina vázaná kovovým iontem je silným nukleofilem (blíže viz Voet-Voetová biochemie) Kovové ionty se účastní katalýzy třemi způsoby: Difuze 2014/201513