Regulace genové exprese Kamila Balušíková

Genová exprese vs. Regulace genové exprese Jednobuněčné organismy: potřeba adaptace na změny podmínek vnějšího prostředí Mnohobuněčné organismy: potřeba selektivní exprese genů → diferenciace rozdílných typů buněk ► k buněčné diferenciaci tedy dochází, protože buňky produkují a akumulují rozdílné sady molekul RNA a proteinů; to znamená, že exprimují rozdílné geny

Genová exprese závisí na různých faktorech: typu buňky jejího okolí jejího věku extracelulárních signálech

každá buňka obsahuje kompletní genom realizuje (exprimuje) ale pouze část genů  NUTNOST REGULACE buňky musí být schopny reagovat na změny prostředí  NUTNOST REGULACE

(B)

Úrovně regulace GE Genom (DNA) Transkripce (DNA → RNA/primární transkript) Posttranskripční úpravy (RNA/primární transkript → mRNA) Translace (mRNA → polypeptidový řetězec) Posttranslační úpravy (polypeptidový řetězec → funkční protein) Degradace proteinů (funkční protein → rozložený protein)

Kroky regulace GE Regulace transkripce – nejekonomičtější X Regulace aktivity proteinu - nejrychlejší

Genom (DNA) Regulace přístupu ke genomové DNA Kondenzace/dekondenzace chromozómu Vyšší stupeň kondenzace způsobuje, že DNA je méně přístupná pro transkripční faktory a RNA polymerázu Struktura chromatinu (heterochromatin x euchromatin

X inactivace X inaktivace (pouze jeden X chromozom je vždy aktivní - Xa, Xi) Netranslatovaná (non-coding) RNA – Xist (X-inactivation specific transcript); Xi je obalován Xist RNA,která je transkribována tímto Xi chr.→ heterochromatin = inaktivace Limiting blocking factor – vazba do X inaktivačního centra (XIC) blokuje inaktivaci (pouze v Xa) Xa – bez Xist RNA není inaktivován

Poziční efekt (PEV – position effect variegation) Každý chromosom. (a tak i gen) má své místo v jádře (dostatek RNA polymerázy, regulačních faktorů, euchromatin) Odlišnosti v expresi genu jsou závislé na poloze tohoto genu v genomu = poziční efekt Pokus s drosofilou : přenesení white genu v chr. (zbarvení oka) na pozici blízkou heterochromatinu – inaktivace genu

Acetylace histonů Histonová acetylace → activace Histondeacetyláza odštěpuje acetylovou skupinu z histonů → DNA méně přístupná

Methylace geny, které se v daném vývojovém stádiu mnohobuněčného organizmu neexprimují, mohou být metylovány (→ jejich exprese je zablokována) Enzym methylázy - katalyzuje methylaci C5 cytosinu v DNA (5-methylcytosin) Methylace CG míst (ostrůvků) (sekvence: -C*G-p-C*G-) Stupeň methylace DNA koresponduje se stupněm genové exprese (methylovaný gen = neexprimovaný gen) Genomický imprinting – pouze jedna kopie genu (od matky x otce) je aktivní

Epigenetika Studuje dědičné změny genové exprese, ke kterým dochází beze změny sekvencí DNA Epigenetické procesy jsou obvykle způsobeny represí transkripce, která je řízena modulací chromatinu Genomický imprinting Poziční efekt Kompenzace dávky genů (X inaktivace) Chemická modifikace DNA, histonů Remodelace chromatinu

Regulace transkripce je kontrolována regulačními proteiny, které se váží k regulačním DNA sekvencím → Založená na interakci protein-DNA Nejekonomičtější způsob regulace Eukaryota: každý gen pod individuální kontrolou, komplexní regulace Prokaryota: reguluje se transkripce celého operonu, jednoduchá regulace Transkripční inhibitory/aktivátory váží specifické promotorové sekvence

DNA vazebné proteiny rozeznávají sekvence především podle velkého žlábku (interakce s povrchem) + geometrie helixu

Regulační DNA sekvence nezbytné pro zapnutí nebo vypnutí transkripce prokaryota – 10 nukleotidových párů krátké (jediný signál) eukaryota – 10 000 nukleotidových párů vzdálené (mikroprocesory) Genové regulační proteiny vazba na regulační DNA sekvence Kombinace DNA sekvencí a jejich asociace s proteinovými molekulami působí jako spínač, který kontroluje transkripci Kontakt = jeden pár bází, který je spojen nekovalentní vazbou s aminokyselinou Regulační protein obsahuje 10-20 takových specifických kontaktů DNA – proteinové motivy = obecné strukturální vzory regulačních proteinů

DNA – proteinové motivy = obecné strukturální vzory regulačních proteinů Základní typy DNA Vazebných proteinů: Leucine zipper Helix-loop-helix Helix-turn-helix Zinc finger

Zinc finger Zn atom - stabilizace typ helix + β sheet (řetězce) helix + helix (dimerizace) Helix-loop-helix Delší smyčka - poloha helixu není fixována Dimerizace (homo i hetero) Regulace - dimerizace s kratším proteinem

Leucine zipper Dimerizace (hydrofobni interakce leucinů) α helixů Helix-turn-helix Krátká smyčka, fixní úhel C koncový helix: vazba do velkého žlábku

Prokaryota účinná odpověď na rychle se měnící fyzikální / chemické podmínky prostředí hlavním smyslem: zajistit přežití buňky regulace především na úrovni transkripce velmi krátká životnost mRNA (cca 3 min.) mRNA polygenní regulace gen. exprese nejlépe prostudována u proteinů s enzymovou funkcí

Regulace transkripce u prokaryot OPERON – transkripční jednotka, sada genů na chromozomu, které jsou regulovány jedním promotorem a operátorem, jsou transkribovány jako jedno dlouhé mRNA vlákno 1 mRNA (nese více genů) = 1 transkripční jednotka polycistronový transkript PROMOTOR – iniciační místo, kde transkripce skutečně začíná, „upstream“ oblast, sekvence vázající RNA polymerasu

OPERATOR – krátká DNA sekvence (dlouhá cca 15 nukleotidů) v promotorové oblasti, na kterou se váží regulační proteiny regulační gen – lokalizován mimo operon, kóduje regulační protein, jeho exprese obvykle konstitutivní (řízena účinností jeho promotoru) regulační proteiny - váží se na oblast promotoru/operátoru, kódovány regulačním genem Protein represor (negativní) - vypíná transkripci genů, potlačuje ji (syntéza tryptofanu) Protein aktivátor (pozitivní) - zapíná transkripci genů, aktivuje ji (odbourávání cukrů, CAP)

Regulace transkripce u prokaryot Jednoduchý způsob regulace Specifické sigma faktory (interakce s RNA polymerázou) Regulační proteiny: aktivátory, represory

Trp operon Tryptofanový represor repressor

Transkripce - eukaryota Eukaryota x prokaryota RNA-polymeráza → prokaryota 1 x eukaryota 3 RNA pol I (rRNA), II (mRNA), III (tRNA, malé RNA) Eukaryotní RNA-pol vyžaduje k zahájení transkripce přítomnost dalších proteinů = obecné transkripční faktory (vazba na promotor, TATA box, maximálně univerzální, evoluční konzervace) Eukaryota mohou ovlivňovat iniciaci transkripce pomocí specifických regulačních proteinů (represor, aktivátor) vzdálených i několik tisíc nukleotidů od promotoru, DNA se ohýbá do blízkosti promotoru, regulace je komplexní – kombinatorická kontrola

Struktura transkripční jednotky eukaryot/prokaryot K iniciaci transkripce u eukaryot musí dojít na DNA sbalené do nukleosomů a v mnohem kompaktnějším chromatinu Struktura transkripční jednotky eukaryot/prokaryot

TATA box je vysoce konzervovaným promotorem eukaryot

Výstavba preiniciačního komplexu a iniciace transkripce RNA polymerase II preiniciační komplex Nasednutí Pol II vyžaduje přítomnost obecných transkripčních faktorů (TFII) TFII jsou multimerní a vysoce konzervované Proteiny se skládají v určitém pořadí a vytvářejí RNA pol II preiniciační komplex

TBP se váže na TATA-box a ohýbá dvojšroubovici DNA TBP je podjednotkou TFIID

Iniciace transkripce

Pouze obecné transkripční faktory většinou nestačí, je nutná přítomnost aktivačních proteinů (pomáhají uspořádání obecných transkripčních faktorů a RNA pol do iniciačního komplexu) x represory zpomalují, blokují místo v DNA, kam se váže aktivátor – enhancer (zesilovač)

Komplex regulačních proteinů – kombinace více efektů

Combinatorial control – kombinační kontrola Skupiny proteinů působí společně tak, aby determinovaly expresi jednoho genu Efekty mnohočetných genových regulačních proteinů se kombinují a determinují míru spuštěné transkripce Efekt jediného genového regulačního proteinu může být rozhodující pro zapnutí nebo vypnutí jakéhokoli genu To se děje na základě kompletování kombinace

Aktivátory Synergický efekt Většinou se váží na vzdálené oblasti Aktivátor může být také represor Acetylace histonů

Represory Represory mohou působit rozdílnými mechanismy

Represory a aktivátory váží histonovou acetylázu a deacetylázu Figure 10-58. Role of deacetylation and hyperacetylation of histone N-terminal tails in yeast transcription control. (a) Repressor-directed deacetylation of histone N-terminal tails. The DNA-binding domain (DBD) of the repressor Ume6 interacts with a specific upstream control element (URS1) of the genes it regulates. The Ume6 repression domain (RD) binds Sin3, a subunit of a multiprotein complex that includes Rpd3, a histone deacetylase. Deacetylation of histone N-terminal tails on nucleosomes in the region of the Ume6-binding site inhibits binding of general transcription factors at the TATA box, thereby repressing gene expression. (b) Activator-directed hyperacetylation of histone N-terminal tails. The DNA-binding domain of Gcn4 interacts with specific upstream-activating sequences (UAS) of the genes it regulates. The Gcn4 activation domain (AD) then interacts with a multiprotein histone acetylase complex that includes the Gcn5 catalytic subunit. Subsequent hyperacetylation of histone N-terminal tails on nucleosomes in the vicinity of the Gcn4-binding site facilitates access of the general transcription factors required for initiation. Repression and activation of some genes in higher eukaryotes occurs by similar mechanisms.

Aktivace regulačních proteinů u eukaryot

Posttranscripční modifikace RNA capping a RNA polyadenylace zvýšení stability mRNA Alternativní splicing RNA editace

Alternativní splicing primární transkript může být sestřižen různými způsoby, odstraněním ne pouze všech intronů, ale také určitých exonů, za vzniku rozdílných mRNA, v závislosti na buněčném typu, kde je gen exprimován, nebo na stupni vývoje organismu - umožňuje eukaryotům zvýšit kódující potenciál jejich genomů - vytváří plasticitu eukaryotické genetické informace - vliv okolních proteinových faktorů na RNA sestřih - dovoluje, aby rozdílné proteiny byly produkovány jedním genem (1 gen – 5 proteinů) - alternativní sestřih je tkáňově specifický

RNA editace Editace RNA - inzerce nebo delece nukleotidů a nebo substituci nukleotidů v přepsané RNA určitá změna přepisované genetické informace např. objevení se nových iniciačních a stop kodonů pomocí gRNA (guide RNA)

Translace Každá molekula mRNA je nakonec v buňce degradovaná (degradace mRNA) Životnost odpovídající mRNA ovlivňuje expresi příslušného genu (delší životnost mRNA znamená vyšší hladinu translatovaného proteinu a naopak) Životnost mRNA je regulovaná nukleotidovými sekvencemi v 3' nepřekládané oblasti mRNA Translace může být také regulovaná vazbou specifického proteinu na mRNA Např. IRP („iron regulatory protein“)/IRE („iron responsive element“) system

Regulace na principu stabilizace mRNA Iron-dependent regulation of the stability of transferrin-receptor mRNA system IRP/IRE

Regulace na principu inhibice translace Iron-dependent regulation of translation of ferritin mRNA system IRP/IRE

Posttranslační modifikace Nově syntetizovaný polypeptidový řetězec – modifikace celou řadou mechanismů, např. štěpení polypeptidového řetězce, vazba molekul Odstranění methioninu z N konce: každý nově syntetizovaný polypeptidový řetězec začíná methioninem Odstranění signální sekvence: signální sekvence je sekvence aminokyselin, která funguje jako signál pro přechod do žádané lokalizace Proteolytické štěpení: formování funkčního proteinu štěpením prekurzorového polypeptidového řetězce (proinsulin → insulin)

Formování disulfidových můstků: vznikají mezi přilehlými cysteiny Stabilizují strukturu proteinu Chemická modifikace aminokyselin fosforylace (vazba fosfátu) hydroxylace (vazba –OH skupiny) Glykosylace: vazba oligosacharidového řetězce (glykoproteiny) Vazba prostetických skupin: vazba prostetické skupiny (neaminokyselinová/neproteinová molekula) může být vyžadovaná pro fungování proteinu (hem v hemoglobinu)

Insulin

Degradace proteinů- proteasome Protein degradation – regulation of the amount of particular protein within the cell Individual proteins vary in their life span Most proteins in cells are degraded by proteasomes Proteasome is a large complex of proteolytic enzymes forming kind of cylinder Proteins are marked for degradation by the covalent binding of a small protein ubiquitin