PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C1

PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C2 Obecná část: Specifická část: Doplňková část: GenomikaDNAKlonování DNA Transgenní rostliny GMO v zemědělství Slovník GMO: historie a zákony Opakování

PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C3  Podstata klonování  Základní kroky klonování  Praktické využití

Klonování = tvorba zcela identických kopií = klony V případě DNA: Množení úseku DNA určité buňky s využitím enzymů cizích buněk PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C4

1. Vnesení (inzerce) cizorodé DNA do klonovacího vektoru 2. Přenos vektoru do hostitelských buněk E. colli, transformace 3. Zmnožení (amplifikace) vektoru v buňkách hostitele, kultivace 4. Výběr (selekce) buněk obsahujících rekombinantní plazmid PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C5

1. Vnesení (inzerce) cizorodé DNA do klonovacího vektoru  Klonovací vektor = nejčastěji bakteriální plazmid  Pomocí restrikčních enzymů se plazmid naruší (otevře)  Mísení s fragmenty DNA, které je potřeba začlenit do plazmidu  Začlenění fragmentu DNA do plazmidu pomocí spojovacích enzymů (ligáz) PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C6

1. Vnesení (inzerce) cizorodé DNA do klonovacího vektoru PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C7 Bakteriální plazmid DNA Gen Izolace plazmidu Narušení plazmidu Vnesení žádaného genu

2. Přenos vektoru do hostitelských buněk = transformace PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C8 Přímý vstup rekombinantní DNA do bakteriální buňky Je potřeba destabilizovat cytoplazmatickou membránu (např. mírným tepelným šokem)

3. Zmnožení (amplifikace) vektoru v buňkách hostitele PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C9 Naočkování bakterií na živné médium Kultivace a vznik kolonií

4. Výběr (selekce) buněk obsahujících rekombinantní plazmid  Každá kolonie vyroste z jedné buňky  Kultivaci je třeba provádět s ohledem na zvýhodnění bakterií z plazmidem – např. přítomnost antibiotika  K odlišení rekombinantních plazmidů se používají speciální geny, Např. modro/bílá selekce v závislosti na schopnosti hydrolyzovat sacharid PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C10

PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce C11