Obecná genetika nádoru, strategie léčby a farmakogenetika Mgr. Spiros Tavandzis Laboratoř klinické genetiky, P&R Lab a.s. Onkologické centrum J. G. Mendela Nový Jičín

Klonální povaha nádoru Vzniká vícečetnými genetickými změnami Všechny buňky nádoru pochází původně z jediné mutované buňky = KLON primární příčina vzniku nádoru = MUTACE Faktory ovlivňující vznik nádoru: genetické faktory + vliv prostředí epigenetické změny: metylace, microRNA

Základní dělení nádorů Benigní (nezhoubný) Maligní (zhoubný) pomalý růst rychlý růst bez invaze do orgánů invaze do orgánů bez angiogeneze angiogeneze nemetastazuje metastazuje ohraničen bez ohraničení podoba s okolní tkání odlišné od okolní tkáně nepostihuje uzliny uzliny zasaženy Některé benigní nádory mohou být nebezpečné např. v CNS – utlačují nervovou tkáň

Maligní nádory podle původu Karcinomy – epiteliální tkáň (90% nádorů) Sarkomy – mezenchymální tkáň Lymfomy – lymfatická tkáň Leukemie – hematopoetická tkáň

Rozdělení nádorů z genetického hlediska Forma nádoru % z celkového počtu výskytu nádoru Celoživotní úroveň rizika vzniku Způsob vzniku ca prsu ca kolorekta Sporadická 80% 75% Populační náhodně (prostředí) Familiální 10-15% 20% Střední polygenní + prostředí Hereditární (predispozice) 5-10% 5% Vysoká monogenní ZÍSKANÁ vs. DĚDĚNÁ ZMĚNA Převážná většina nádorů vzniká spontánně aktivací určitých genů nebo jejich vyřazením z funkce = kancerogeneze

Úrovně ochrany organismu před látkami přijímanými z prostředí (xenobiotiky) Organismální (vylučování, pocení) Tkáňová (chemická modifikace xenobiotik v játrech) Buněčná (aktivita imunitních buněk, tvorba protilátek, apoptóza poškozené buňky) Molekulárně genetická (reparace poškození DNA) v těle vzniká v průběhu života cca 30-50 mutací/dipl. genom/generaci. Příjem xenobiotik: potrava, tekutiny, vzduch = část negenetické složky variability

Proces kancerogeneze INICIACE PROMOCE PROGRESE PRENEOPLASTICKÁ LÉZE Apoptóza Buněčná toxicita Buňka s adukty Iniciovaná buňka Reparace DNA Normální buňka Buněčné dělení MALIGNÍ NÁDOR PRENEOPLASTICKÁ LÉZE endokrinní faktory zánět výživa GENOTOXICKÉ kancerogeny NEGENOTOXICKÉ kancerogeny Genetické změny Detoxikační Systémy buňky Další genetické změny

Proces kancerogeneze Iniciace (mutace, onkogenní viry) - trvalá změna v DNA Promoce – růstová výhoda Progrese - zisk dalších výhod (neomezený růst, únik apoptóze, neoangiogeneze, nezávislost na podnětech) Metastáze – extracelulární matrix, migrace, PRO MALIGNÍ TRANSORMACI BUŇKY JE NUTNÝCH 6 – 7 GENETICKÝCH ZMĚN

Vznik nádoru je boj mezi obrannými mechanizmy organizmu a nově získanými vlastnostmi nádorové buňky Základní úkol zdravé buňky je udržet svou genetickou informaci bez poškození

Zisk nových vlastností Neomezený růst (vysoká aktivita telomerázy) Angiogeneze (zvýšená exprese VEGF) Nezávislost na růstových signálech (autokrinní stimul) Nereaguje na sebevražedné signály Schopnost invaze (aktivní metaloproteázy, kolagenázy) Schopnost průniku do krve nebo lymfy (poškození mezibuněčné adheze Tyto vlastnosti jsou v zájmu farmaceutických firem

Maligní transformace buňky Dobré, špatné, ještě horší… DOBRÉ – jsme schopni se bránit Reparace (mutátorové geny) Detoxikační systémy ŠPATNÉ – poškození reparace = zvýšení mutační rychlosti až 1000x - poškození genů detoxikačního systému POŠKOZENÍ INTEGRITY GENOMU JEŠTĚ HORŠÍ – ztráta nádorového supresoru nebo aktivace protoonkogenu NEJHORŠÍ – kombinace a kumulace změn

Molekulární podstata kancerogeneze AKTIVACE PROTOONKOGENU Funkce protoonkogenů: regulace b. dělení, přenos signálu Mutace protoonkogenů v somatických buňkách = nedědí se Účinek mutace na fenotyp: autozomálně dominantní Protoonkogen → onkogen → onkoprotein (cíl terapie) aktivace Způsoby aktivace: Mutace: c-K-ras ztráta GTPázové aktivity – trvale aktivní Amplifikace: c-Myc Translokace: fůze bcr-abl Inzerční mutageneze: transdukce retrovirů

Molekulární podstata kancerogeneze produkty ONKOGENŮ Transkripční faktory: MYC, FOS, JUN Nereceptorové proteinkinázy: G-proteiny: RAS Růstové faktory: EGF Receptory růstových faktorů: EGFR microRNA inhibující nádorové supresory Potenciální terapeutické cíle

Molekulární podstata kancerogeneze NÁDOROVÉ SUPRESORY Funkce nádorových supresorů: potlačení proliferace buněk Mutace v zárodečných buňkách = dědičná predispozice (AD) Účinek mutace na fenotyp: autozomálně recesivní ztrátou heterozygozyty (mutace, delece, nondisjunkce atd.) Rb - retinoblastom APC – familiální adenomatózní polypóza TP53 - Li-Fraumeniho syndrom (mutován u 50% nádorů) BRCA1/2 - karcinom prsu / vaječníků MSH2, MLH1 – kolorektální karcinom Reparační geny

Léčba nádoru Chemoterapie: Radioterapie – zlomy v DNA DNA poškozující (deriváty cis Pt) mitotické jedy (vinblastin apod.) – zástava replikace Radioterapie – zlomy v DNA Hormonální terapie (Tamoxifen) Biologická léčba: Antiangiogenní Diferenciační Inhibitory proteazomu Inhibitory tyrosinkináz Léčba monoklonálními protilátkam

Biologická léčba nádoru Antiangiogenní Diferenciační Inhibitory proteazomu Inhibitory tyrosinkináz Léčba monoklonálními protilátkami

Cílové struktury léčiv Složky signálních drah (fůzní produkt bcr-abl – Glivec , CML) Receptory (EGFR, HER2/neu, ca prsu) proteazómy Při léčbě sledovány také jiné markery Predikce Prognóza Ultrastaging Sledování (MRN)

Cílové struktury léčiv Složky signálních drah Produkt fůzního genu bcr-abl: vznik translokaci t(9;22), chybí kinázová reg. doména → trvalá aktivita kinázy abl Detekce fůzního produktu PCR CML -> lék Glivec = kompetitor původního substrátu Fůzní produkty: Major – CML a 30-50% ALL Minor - ALL

Cílové struktury léčiv Receptory (HER2/neu,c-erbB2) Amplifikace u 15-25% invazivních ca prsu: lék Herceptin (Trastuzumab) Popis léku Použití Účinek Vznik rezistence k němu

Cílové struktury léčiv Receptory

Detoxikační systém buňky - systém gp-P Gp-P protein kódován genem MDR1 (multidrug-resistance) Rodina ABC transporterů (ATP binging cassette), 7 podrodin Široká substrátová specifita Funkce: transport xenobiotik přes intra- a extracelulární membrány (ATP-dependentní „odtoková“ pumpa xenobiotik) Lokalizace: játra, ledviny, střeva Způsobuje rezistenci vůči široké škále lékům, včetně protinádorových.

Detoxikační systém buňky - systém cytochrómu P450 První fáze detoxikace - transformační: zvyšování polarity xenobiotik (např. vazbou -OH skupin) Účast také na přeměně promutagenů na genotoxické kancerogeny (epoxidy ap.) Monooxygenázy závislé na cytochromu P450: Flavinové oxygenázy (odstraňují sloučeniny obsahující N,S,P) Reduktázy ADH, SOD, glutathionperoxidázy, katalázy Druhá fáze detoxikace - konjugační: konjugace s produkty buňky a vyloučení GST -> vysoká hladina v nádorech, braní léčbě Metyltransferázy- př. TPMT (thiopurin-S-methyltransferáza) UDP-glukuronozyltransferázy - > glukuronidace (játra, ledviny)

Detoxikační systém buňky - systém cytochrómu P450 Aktivita enzymů (odezva na léčbu) je ovlivněna: faktory prostředí (podávání enzymových inhibitorů, strava, hormony apod.) mutacemi v důležitých oblastech genů, které je kódují pomalí metabolizátoři – mutace na obou alelách = kompletní deficit daného enzymu = kumulace léčiv (TOXICITA) středně rychlí metabolizátoři – mutace na jedné alele – dostačuje běžná dávka rychlí metabolizátoři - bez mutace = nedostatečná hladina léku (běžná dávka neúčinná)

Zpracování xenobiotik systémem cytochromu P450 Monooxygenázy závislé na cytochromu p450: nadrodina CYP 18 rodin podrodiny A-Q Široká substrátová specifita (psychofarmaka,chemoterapeutika, imunosupresiva atd.) inducibilita

Nežádoucí účinky léků jsou 4. až 6. nejčastější příčinou úmrtí v USA.

Důvody rozdílné odezvy na léčbu Individualita každého organismu: Stejný lék -> různí lidé -> různá odezva (rezistence , toxicita, normální metabolizace) (interakce genotyp <-> prostředí) Rychlejší odstraňování léku z buněk (větší počet ABC transportérů) Snížená / zvýšená aktivita enzymu detoxikačního systému (mutace enzymů detoxikační kaskády) V buňkách mohou chybět nebo mohou být změněny cílové proteiny pro použitý lék (mutace, změna exprese) Vliv prostředí (hormony, strava, léky apod.) NUTNÁ ÚPRAVA DÁVKY NEBO ZMĚNA LÉKU

Farmakogenetika(-omika) Zkoumá účinnost léčby v závislosti na genotypu jedince. Důvodem rozdílné odezvy na léčbu je variabilita na úrovni DNA(polymorfismy, delece, inzerce) Farmakogenetika (-omika) poskytuje odpovědi na otázky: Jak léčit? - správný výběr léku (lék na míru) Koho léčit? - výběr pacientů podle profitu z léčby PREDIKCE a PROGNÓZA

Farmakogenetika nebo farmakogenomika? Farmakogenetika: analýza jednoho nebo několika polymorfismů u známých genů asociovaných s metabolizaci určitého léku. DNA úroveň – vliv mutace na aktivitu enzymu Farmakogenomika: analýza expresního profilu velkého počtu nespecifikovaných genů (desítky až tisíce genů) u vybrané skupiny pacientů. RNA úroveň - porovnáváním expresních profilů lze : vytipovat nebo sledovat expresi skupin genů asociovaných s odpovědi na léčbu (neúčinnost léčby, toxicita). zjistit skupiny pacientů s příznivou x nepříznivou prognózou

Metody farmakogenetiky PCR – sledování patogenních mutací ve vybraných genech Q-RT-PCR - sledování úrovně exprese několika genů Microarrays – souběžná analýza velkého počtu genů (řádově až tisíce) – vyhledávání odlišností v expresním profilu

Prognóza onemocnění a predikce léčby Prognóza: dle výsledku stagingu a gradingu nutné průběžně monitorovat účinek zvoleného léku. Včasný záchyt mikrometastáz (sledování MRN)

Prognóza Klinický a histopatologický odhad rizika je založen na sledování nepřímých parametrů: Věk Velikost nádoru Postižení lymf uzlin Histologický grade atd. Tyto směrnice mohou vést ke zbytečné léčbě mnoha pacientů! Způsob léčby dle doporučení směrnic EU a US

Prognóza a monitoring léčby Standardně používané metody Histologie a IHC: PCAN, Ki67 prolif. aktivita, onkoproteiny, receptory HER2, ER Fyzikální metody (MRI, CT apod.) Biochemické a sérologické metody (ELISA) Cytogenetika

Prognóza a monitoring léčby Molekulárně biologické a genomické metody Imunomagnetická selekce nádorových buněk Krev Ultrastaging - exprese vybraných genů asociovaných s nádorem Q-real time RT-PCR Low density arrays Microarrays Primární nádor