Organogeneze, somatická embryogeneze 1 MORFOGENEZE Organogeneze, somatická embryogeneze Regenerace nového prýtu: restitucí reprodukcí regenerací de novo (Organogeneze, somatická embryogeneze)

Organogeneze, somatická embryogeneze 1 MORFOGENEZE Organogeneze, somatická embryogeneze Regenerace nového prýtu: restitucí reprodukcí regenerací de novo (Organogeneze, somatická embryogeneze) Diferenciace, dediferenciace, rediferenciace

? Představa: Všechny buňky mají jádro  jsou totipotentní 2 ? Představa: Všechny buňky mají jádro  jsou totipotentní  indukce  vytvoření nového jedince Neplatí !!! Totipotence buňky nestačí, je třeba, aby buňka byla kompetentní ?? Proč nejsou všechny buňky kompetentní ? Důvody genetické epigenetické fyziologické ?? Proč postupně nereagují všechny buňky ? vymizení gradientů vyčerpání živin zdroj/sink interakce

Vytváření meristematických center Morfogeneze in vitro 3   Izolace explantátu Signál(y) Izolace, poranění změna prostředí Kompetence dediferenciace Neorganizovaný růst Signál(y) Nové gradienty Vytváření meristematických center Nové vztahy Determinace Signál(y) Rediferenciace Organizace Organogeneze unipolární struktury Embryogeneze bipolární struktury

Vztahy dějů při morfogenezi 4 Vztahy dějů při morfogenezi Totipotence Signál(y) Signál(y) Kompetence získání kompetence Determinace !!! Hlavní problém …. Poznání charakteru příslušných signálů V praxi může být obtížné .. často empirický přístup.. Totipotence x kompetence x indukce x determinace

Vytváření meristematických center Morfogeneze in vitro 1   Izolace explantátu Signál(y) Izolace, poranění změna prostředí Kompetence dediferenciace Neorganizovaný růst Signál(y) Nové gradienty Vytváření meristematických center Nové vztahy Determinace Signál(y) Rediferenciace Organizace Organogeneze unipolární struktury Embryogeneze bipolární struktury

Navržený model organogeneze in vitro …. 2 Navržený model organogeneze in vitro …. Působení vhodné kombinace podmínek (hormonální rovnováha) Přenos hormonálních signálů Dediferenciace Aktivace genů, remodelace chromatinu.. Aktivace pluripotentních genů a vytvoření niky kmenových buněk Zhao et al., 2008

Navržený model organogeneze in vitro …. 3 Navržený model organogeneze in vitro …. Působení vhodné kombinace podmínek (hormonální rovnováha) Přenos hormonálních signálů Dediferenciace Aktivace genů, remodelace chromatinu.. Aktivace pluripotentních genů a vytvoření niky kmenových buněk Zhao et al., 2008

4 Působení vhodné kombinace podmínek (hormonální rovnováha) Polární transport auxinů, asymetrická distribuce hormonů Změny ve struktuře chromatinu, epigenetické modifikace Aktivace WUS a CLV3 genů Rediferenciace Změny v koncentraci a distribuci hormonů Změny ve struktuře chromatinu, epigenetické modifikace Aktivace genů identity orgánů Tvorba orgánů Zhao et al., 2008

Př.: Co se děje při získávání kompetence ? 5 Př.: Organogeneze u Arabidopsis thaliana SIM Pupeny Kořenový explantát (hypokotylový explantát) CIM Kalus RIM PreCIM Kořeny Start 4 dny 10 dní Kompetence Determinace Co se děje při získávání kompetence ? X Geny up-regulované více než 10x, (230), z nich pak největší zastoupení transkripční faktory, Geny down-regulované více než 10x, (520), mezi nejvíce down regulovanými – peroxidázy, dále proteiny asociované s membránami (chloroplastovou, mitochondriální, ER, Golgi) Che et al., 2006

X geny s odlišnou expresí od situace a pro jiné složení 6 Geny s odlišnou expresí od situace Co se děje při determinaci ? X geny s odlišnou expresí od situace a pro jiné složení média ( CIM x SIM x RIM) 4 dny CIM SIM=médium bohaté na cytokininy Geny up-regulované (478), ARR, geny GA metabolismu, transkripční faktory, proteiny s chloroplastovou destinací… Geny down-regulované (397), proteiny s jadernou destinací… CIM  pre CIM Geny up-regulované (241), geny zahrnuté do remodelingu chromatinu, geny stresové odpovědi… Geny down-regulované (373), proteázový inhibitor, peroxidázy… RIM  médium bohaté na auxiny Geny up-regulované (558), proteiny spojené s vývojem buněčných stěn a vodivých pletiv, s transportní aktivitou; peroxidázy… Geny down-regulované (583), cytokinin oxidáza, proteiny účastníci se metabolismu karotenoidů… Che et al., 2006

Vznik meristematických center Morfogeneze in vitro 7   Izolace explantátu Signál Izolace, poranění změna prostředí Kompetence Neorganizovaný růst Signál Nové gradienty Vznik meristematických center Nové vztahy Determinace Signál Rediferenciace Organizace Organogeneze unipolární struktury Embryogeneze bipolární struktury

Organogeneze Unipolární útvar 8 Organogeneze Přímá - vývoj prýtů, resp. kořenů přímo z indukovaných buněk primárního explantátu Nepřímá- odvození kalusu - tkáňové kultury a následně indukce vývoje prýtu resp. kořenů Počáteční fáze- tvorba meristemoidu.. soubor malých izodiametrických buněk, Ø vakuoly, vysoký podíl obsahu jaderného materiálu Unipolární útvar Vliv růstových regulátorů: auxiny, cytokininy, rozhoduje konečná endogenní rovnováha – interakce počáteční endogenní hladiny a vlivu exogenních růstových regulátorů Velké rozdíly v požadavcích různých genotypů Př: Otočení kalusu vzhledem k médiu v různém čase  vytváření meristemoidů na různých místech kalusu Passiflora edulis = mučenka purpurová Passiflora edulis Fernando et al., 2007 Př: Indukce tvorby prýtů X poměr Cytokinin:Auxin často pozitivní kombinace dvou auxinů či cytokininů u jehličnanů často stačí pouze aplikace cytokininů u trav jen nízká hladina cytokininů u vojtěšky- vysoký poměr A:C při indukci z kalusu Proces lze ovlivnit řadou dalších látek: puriny, pyrimidiny, ABA, polyaminy, etylén..

Vznik meristematických center Morfogeneze in vitro 9   Izolace explantátu Kompetence Izolace, poranění změna prostředí Neorganizovaný růst Signál Nové gradienty Vznik meristematických center Nové vztahy Signál Determinace Rediferenciace Organizace Organogeneze unipolární struktury Embryogeneze bipolární struktury

Somatická embryogeneze 10 ??? Somatická embryogeneze Embryogeneze  zygota Bryophyllum Somatická embryogeneze in vivo: buňky samičího gametofytu (citrusy-běžně vývoj adventivních embryí, ale dokončený vývoj jen při vtlačení do zárodečného vaku… 1-40 embryí v semeni) Somatická embryogeneze in vitro: vývoj embryí ze somatických buněk posloupností morfologických změn obdobných těm při vývoji zygotického embrya. U některých rostlin: všechna pletiva, u jiných jen některá pletiva responsivní (mrkev X obilniny, reproduktivní pletiva) Př: 1993… 123 druhů z 56 čeledí a 81 rodů, 1995… 1000 druhů somatická embryogeneze in vitro organogeneze somat. embryogeneze Použití : Studium zárodečného vývoje rostlin Množení rostlin Pomerančovník, SE odvozené z jedné buňky, G.Vogel, 2010 Unipolární útvar, spojení s mateřským pletivem Bipolární útvar, izolace od mateřských pletiv

Vzestup obsahu cytoplasmy- „meristematické“ buňky 12 Modelová kultura odvozená z kořene mrkve Vývoj kompetentních buněk s kapacitou reagovat na indukční působení (závisí na genotypu, stavu „diferenciace“, poloze buněk v pletivu, vývojové fázi) Indukční fáze + 2,4 D – auxin - 2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina Determinační fáze Transformační fáze Iniciační fáze DNA dediferenciace DNA metylace Vzestup obsahu cytoplasmy- „meristematické“ buňky Dělení buněk, embryogenní centra Fáze množení (proliferace) + 2,4 D Fáze realizační Ø 2,4 D !!! globulární srdčité torpédovité zralé embryo

Proliferace embryogenní kultury 13 Proliferace embryogenní kultury Př: Somatická embryogeneze smrku ztepilého Iniciace  Proliferace  Zrání + Desikace  Klíčení Proliferace: 5 µM 2,4-D, 2 µM KIN, 2 µM BAP; Zrání: bez auxinů a cytokininů, 20 µM ABA Zrání somatických embryí 4. týden 5. týden 6. týden Kotyledonární stádium 200 μm 500 μm 1. týden 2. týden 3. týden Rané somatické embryo Cylindrické stádium Prekotyledonární stádium 150 μm

Jaké vnější podmínky rozhodují ?? Klíčová role: auxin 14 Jaké vnější podmínky rozhodují ?? Klíčová role: auxin 1. fáze indukce a množení --- nutná přítomnost auxinu (někdy spolu s cytokininem) 2. Fáze realizační --- nutná nepřítomnost auxinu Su et al., 2011 Př: habituovaná tkáňová kultura Citrus sinensis (soběstačná v produkci auxinu)  inhibice embryogeneze Inhibice syntézy auxinu Degradace auxinu ozářením znovuustavení schopnosti embryogeneze

Jaké další vnější podmínky působí ?? Inhibice: gibereliny Pozitivní ovlivnění zrání: ABA Su et al., 2011 Etylén: inhibice vysokými koncentracemi, stimulace nízkými koncentracemi Stimulace glykoproteiny uvolňovanými z embryogenních buněk Zdroj N: NH4+ podporuje embryogenezi, Embryogenezi lze navodit bez přidání auxinu: • Osmotickým stresem • Těžkými kovy • Poraněním (zygotická embrya - mechanické poškození), ale !!! .. výtěžky jsou výrazně nižší

Př: Somatická embryogeneze u fotoautotrofní kultury 15 Př: Somatická embryogeneze u fotoautotrofní kultury +2,4 D +2,4 D +2,4 D Fotoautotrofní kalus Kalus (cukr) Řapík (cukr) List mrkve +2,4 D -2,4 D Medium bez cukru Ø embryogeneze +2,4 D -2,4 D vývoj embryí Medium s cukrem ?? Jakou roli hraje cukr ? Zdroj energie a C ? Osmotikum ? Signál ?  CO2  zvýšení produkce cukru  růst srovnatelný s kontrolou  Ø embryogeneze Př: Helianthus annum : konc. sacharózy: klíčový faktor při indukci: rozhoduje o typu morfogeneze: nízká koncentrace  organogeneze; vysoká koncentrace embryogeneze

Problémy při pěstování somatických embryí 16 Problémy při pěstování somatických embryí abnormální embrya X zygotická embrya předčasné klíčení vitrifikace sekundární embryogeneze ztráta morfogenního potenciálu genetická hypotéza fyziologická hypotéza kompetitivní hypotéza Rychlost ztráty morfogenního potenciálu závisí velmi na genotypu Př: smrk, mrkev: embryogenní kultura bez ztráty potenciálu i několik let růže: kultura ztrácí potenciál již po třech subkultivacích Kryoprezervace : uchování kultur při nízkých teplotách

Regenerující rostlina 17 Pylová embryogeneze – androgeneze Výchozí materiál – izolované prašníky izolovaná (nezralá) pylová zrna 1964 1. haploidní rostliny (durman) Stadium vývoje … rozhodující .. většinou ve stadiu dvojjaderného pylu Indukční působení - různé typy stresu --- teplotní šok, osmotický šok, hladovění  Vznik haploidních rostlin 60µm 200µm 2,5 mm 1,5 cm mikrospory Dělící se buňky Pro-embryo Embryo Regenerující rostlina Triticale, Oleszcuk et al., 2004

18 Pylová embryogeneze ozimé řepky kolchicin Smýkalová et al., 2006

Gynogeneze- možná, ale málo používaná 19 Gynogeneze- možná, ale málo používaná Výchozí materiál – izolovaná vajíčka (makrosporangia), Stadium vývoje … časné stádium, před rozkvětem, nesmí dojít k samoopylení, lepší výsledky s vajíčky z postranních větví.. Indukční působení - různé.. např. předpůsobení nízkými teplotami, vysoké hladiny sacharózy.. různé požadavky na světelné podmínky..  Vznik haploidních rostlin 1976 1. haploidní rostliny (ječmen) původ somatických embryí různý u různých rostlin: rýže : synergidy; ječmen antipody a vaječná buňka

20 Somaklonální variabilita Def. : Fenotypová variabilita genetického nebo epigenetického původu, zejména u rostlin odvozených z buněčných kultur in vitro. …. vysoký výskyt odchylek od původního fenotypu genetické změny: změny ploidie, multiplikace genů, změny v uspořádání genů, rozsáhlé i bodové mutace epigenetické změny Př: kortex stonku list. explantát tabák C+ kalus C- kalus

Indukce odchylek abnormálními situacemi při kultivaci 21 Epigenetické změny DNA metylace metylace C Modifikace histonů acetylace, metylace, fosforylace, vazba s proteiny, cukry.. Interference siRNA, miRNA řízení metylace DNA Variabilita mezi jedinci X variabilita buněk jedince Rostliny: modifikace histonů nepřenosné přes meiosi, metylace DNA částečně ano Kultivace neorganisovaně rostoucích buněk – kalus, tkáňová kultura - znamená riziko nebo výhodu získání fenotypově odlišných jedinců Indukce odchylek abnormálními situacemi při kultivaci Preexistence odchylek ve výchozím materiálu Co je příčinou ?? ! Antibiotika - kanymycin, hygromycin, cefotaxim… změny metylace ! Miguel a Marum, 2011

Mutanty odvozené díky kultivaci tkáňové kultury in vitro 22 Mutanty odvozené díky kultivaci tkáňové kultury in vitro Metabolická dráha syntézy antokyanů Flavonoid 30,50-hydroxyláza (F3050H)- kódující sekvence je nezměněna, výchozí typ: promotor – přítomnost transpozonu, aktivace transpozonu při kultivaci in vitro Sato et al., 2011

Organogeneze, somatická embryogeneze 23 explantát Prašník, pyl embrya (2n) (2n) (n) (n) kalus kalus (2n) Buněčná kultura Buněčná kultura (n) (2n) (n) protoplastová kultura DNA inkorporace DNA inkorporace protoplastová kultura (n) (2n) kolchicin izolovaná buňka klon izolovaná buňka klon (2n) (n) (2n) Protoplastová fúze Organogeneze, somatická embryogeneze (n) (2n)

Protoplastová kultura 24 Orgánová kultura Prašníková kultura semeno embryo Regenerant Somatická embrya Kalus Embryo Kalus Kalus Orgánová kultura Buněčná kultura Orgánová kultura Protoplastová kultura diferenciace dediferenciace