Imunocytologická diagnostika leukemizovaných B-lymfoproliferací (aneb není lymfocyt jako lymfocyt)‏ D. Starostka, P. Mikula, L. Novosadová, *M. Bílý Oddělení klinické hematologie Nemocnice s poliklinikou Havířov, p.o. *Dept. of Haematology Craigavon Area Hospital, Craigavon, UK

WHO Classification of Tumours Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues (2001)‏ „Within each category, distinct diseases are defined according to a combination of morphology, immunophenotype, genetic features, and clinical syndromes. For each neoplasm, a cell of origin is postulated.“

Vývoj hematopoetických řad

Antigeny B-lymfocytu Proteinová tyrosinkináza TCR-zeta asociovaný protein, 70 kDa ZAP-70 Regulace, aktivace a diferenciace B-lymfocytu Glykoprotein 105 kDa FMC-7 Adhesivní molekula Transmembránový heparan-sulfát-proteoglykan (Syndecan-1)‏ CD138 Integrin - aE podjednotka Dvouřetězcový heterodimer, 25 a 150 kDa CD103 Struktura BCR komplexu Glykoprotein, 33-45 kDa, asociace se SmIg CD79a/CD79b Receptor pro TNF Glykosylovaný fosfoprotein, 44-48 kDa CD40 Enzym (NAD-glykohydroláza, ADP-ribosylcykláza, cyklická ADP-ribózo-hydroláza)‏ Integrální membránový glykoprotein, 45 kDa CD38 Receptor pro IL-2 Glykoprotein, 55 kDa CD25 Low-afinity receptor pro IgE Transmembránový glykoprotein, 45 kDa, asociace s MHC II. tř. CD23 Aktivace a diferenciace B-lymfocytu, ztráta po aktivaci B-lymfocytu před stadiem plasmocytu Transmembránový glykoprotein, isoformy 130 a 140 kDa CD22 C3d receptor, EBV receptor, aktivace a proliferace B-lymfocytu Transmembránový glykoprotein, 145 kDa CD21 Membránový protein, isoformy 33-37 kDa CD20 Membránový glykoprotein, 95 kDa CD19 Integrin - aX podjednotka Transmembránový glykoprotein, 145-150 kDa CD11c Neutrální endopeptidáza Integrální membránový protein, 100 kDa CD10 CD72 ligand Transmembránový glykoprotein, 1 řet. 67 kDa CD5 Funkce Struktura Marker

Expresní profil B-lymfocytu

Leukemizace lymfomů Detegovatelná přítomnost lymfomových buněk v periferní krvi spojená s postižením kostní dřeně integrální součást klinického obrazu některých lymfoproliferací častá u některých lymfoproliferací (odráží pokročilost choroby)‏ u jiných lymfomů raritní

Zralé B-lymfoidní neoplázie (WHO)‏ DLBCL Mediastinální LBCL Intravaskulární LBCL Primary effusion lymphoma Burkittův lymfom/leukémie Plasmocelulární dyskrázie (PCL)‏ B-CLL/SLL B-PLL HCL MCL FL MZL (nodální, splenický, extranodální MALT-typ)‏ LPL

Zralé periferní (postthymické) T-neoplázie (WHO)‏ Leukemické/diseminované – T-PLL, T-LGL leukémie, ATL/L Nodální – angioimunoblastický T-lymfom, periferní T-lymfom nespecifikovaný, anaplastický velkobuněčný lymfom Kožní – mycosis fungoides, Sézaryho syndrom, primární kožní anaplastický velkobuněčný lymfom Ostatní extranodální – extranodální NK/T-lymfom nasálního typu, s enteropatií asociovaný T-lymfom, hepatosplenický T- lymfom, subkutánní panniculitis-like T-lymfom

Diferenciální diagnostika leukemizovaných lymfoproliferací je imunocytologická Cytomorfologická a imunologická variabilita - cytomorfologie (MG-GR)‏ - důkaz klonality (FCM)‏ - charakteristický imunofenotyp (FCM)‏ Synergický diagnostický efekt směřující často ke konečné diagnóze

Y Y Imunofenotypizace mab2 PE Imunologická typizace jednotlivých buněčných populací za využití vizualizované reakce antigenu s monoklonální protilátkou označe- nou fluorochromem (FITC, PE, PC5, aj.)‏ Buněčná lokalizace antigenů (markerů, znaků): Povrchová (membránová). Intracytoplazmatická. Nukleární (jaderná). Praktické provedení imunofenotypizace: Průtoková cytometrie – multiparametrová analýza Fluorescenční mikroskopie Y mab2 PE Y mab1 FITC

Zdroje materiálu pro imunocytologickou diagnostiku Periferní krev Kostní dřeň Tělesné tekutiny (punktáty a likvor)‏ Suspenze buněk solidních tkání

Pracovní postup FCM imunofenotypizace Stanovení buněčnosti vyšetřované suspenze Pipetování vzorku Značení MoAb Inkubace Lýza erytrocytů a promytí Resuspenze v pufru (PBS)‏ Analýza

Laser (Air-cooled Argon Ion Laser)‏ Čočky upravující tvar paprsku „Beam Shaping Lenses“ Průtoková kyveta „High Sensitivity Quartz Flow Cell“ Detektor pro „Forward Scatter“ „Side Scatter“ 525BP FL1 (FITC)‏ 575BP FL2 (RD1)‏ 620BP FL3 (ECD)‏ 675BP FL4 (PC5)‏ 488DL 488BK 550DL 600DL 645DL

Monoklonalita v B-linii – restrikce lehkých řetězců Problém: gate

Imunofenotyp chronických B-lymfoproliferací

Rozdíly v imunotypu lymfomových buněk uzliny, KD a PK Lymfatická uzlina 48,0 % Kostní dřeň 23,4 % Periferní krev 6,0 %

Skórovací systém pro B – CLL Matutes E. et al Skórovací systém pro B – CLL Matutes E. et al.: The immunological profile of B-cell disorders and proposal of a scoring system for the diagnosis of CLL. Leukemia, 1994, 8, 1640-45 silná pozitivita slabá či max. střední pozit./negat. CD79b (dříve CD22)‏ pozitivní negativní FMC7 CD23 CD5 slabá/střední pozitivita SmIg (lehké řetězce)‏ MEMBRÁN. ZNAK 1 BODY

Analyzovaný soubor leukemizovaných B-lymfoproliferací– OKH Havířov Období 1/2003-12/2005 Vzorky periferní krve, celkem 192 vzorky od 192 pacientů Nová diagnóza Leukocyty 1.6 – 257.1 giga/l (Coulter STKS, Sysmex XTi)‏ Zastoupení lymfocytů 0.30 – 0.98 numfr. (manuální diferenciální rozpočet)‏ Cytomorfologie (MG, GR)‏ Flow-cytometrie (přímá fluorescence, Coulter Epics XL, monoklonální protilátky Immunotech, Dako, Becton- Dickinson)‏ CD3, CD4, CD8, CD16/56, CD19, CD5, CD10, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD38, CD11c, CD79b, FMC7, SmIg Semikvantitativní stupeň exprese Skóre dle Matutes et al. Korelace exprese CD38 a mutačního stavu IgVH genu-B-CLL

Zastoupení diagnóz dle WHO 1 vHCL 7 HCL 2 LPL 3 B-CLL/PLL 9 MLUS 10 Blíže nespecif. B-NHL FL 9 (1)‏ MZL (vč. SLVL)‏ 13 MCL 135 B-CLL Počet Diagnóza

Pan-B+, CD5+

Pan B+, CD5+

Pan B+, CD5+

Pan-B+, CD5-, CD10+

Pan-B+, CD5-, CD10-

Pan-B +++, CD10-, CD5-, CD103+++

Pan-B+, CD10-, CD5-

Pan-B+, CD10+, CD5-

Pan-T, CD8+

Exprese povrchových markerů (%)‏ 94 100 2.5 LŘ high 50 46 FMC7 posit. 16 15 CD11c posit. 83 7 CD79 high 22 31 12 CD38 posit. 8 CD25 posit. 89 SmIg high 84 CD23 posit. 38 28 B-NHL LPL MCL 58 6 98 B-CLL CD22 M/H CD21 posit. CD20 high CD5 posit.

Významné diferenciálně diagnostické faktory leukemizovaných lymfomů‏ Komplexní pohled na diagnózu, indolentní B-lymfomy Cytomorfologie Rozdílnost pojmů „pozitivita“ a „síla exprese“ při vyšetření imunofenotypu Přítomnost CD5 (dominantní zastoupení B-CLL)‏ Přítomnost CD23 (specifická pro B-CLL)‏ Vysoká exprese CD20, CD79b a SmIg a středně silná či vysoká exprese CD22, positivita FMC7 (specifická pro non-B-CLL lymfomy)‏ Přítomnost CD103 (specifická pro HCL)‏ Přítomnost CD10 (specifická pro FL při „indolentní morfologii“)‏

Významné diferenciálně diagnostické faktory leukemizovaných lymfomů‏ Malý dif.dg. význam CD19, CD21, CD11c, CD25, CD38 Nespolehlivost exprese CD38 jako korelátu mutačního stavu IgVH genu Matutes 4-5 u 90% B-CLL Problematické stanovení klonality v T-linii Velký význam cytomorfologie u T-lymfomů vzhledem k absenci unikátních imunofenotypů Lymfomy šedé zóny existují i v době superspecializované diagnostiky (nové entity v rámci WHO klasifikace ?)‏

Děkuji za pozornost !