Replikace DNA Tato prezentace se zabývá procesem Replikace DNA.

Obsah Co je výsledkem replikace Replikační počátky a replikační vidličky DNA-polymerasa Asymetričnost replikační vidličky Korektorská schopnost DNA-polymerázy Primasa Okazakiho fragmenty Kliknutím na příslušný nadpis přejdete na příslušný snímek. Na obsah se vždy vrátíte kliknutím na animační tlačítko Obsah. Replikační aparát Animace Použitá literatura

Nově syntetizovaný řetězec DNA Replikace DNA dává vznik dvěma novým vláknům. Obr. 1. Replikace – schéma Templát (matrice) A T G C A T G C A T G C Nově syntetizovaný řetězec DNA Obsah

Replikační počátky a replikační vidličky Celý proces replikace začínají iniciační proteiny v místech, které se nazývají replikační počátky. dvoušroubovice DNA Replikační počátek Replikační počátky se v průběhu replikace zvětšují za vzniku tzv. replikačních vidliček. Lidský genom, který má přibližně 3x109 nukleotidů má zhruba 10 000 replikačních počátků. Jejich velký počet umožňuje lidské buňce zreplikovat veškerou DNA během relativně krátké doby. Replikační vidlička Obsah

Obr. 2. Replikační vidlička Replikační vidličky V replikačních vidličkách jsou navázány proteiny replikačního aparátu, které se pohybují ve směru replikace a rozvíjejí dvoušroubovicovou strukturu za současné syntézy nového řetězce. Animace znázorňuje rozpletení dvoušroubovicové struktury. Obr. 2. Replikační vidlička Obsah

Obr. 3. Obousměrná replikace Replikační vidličky V jednom replikačním počátku se vytvoří dvě replikační vidličky, které se pohybují směrem od sebe, a proto je tato replikace nazývána obousměrná. Replikační vidlička Směr replikace Směr replikace Začátek replikace Obr. 3. Obousměrná replikace Obsah

Obr. 4. Vznik fosfodiesterové vazby (1. část) DNA-polymerasa 3' 5' Nejdůležitějším enzymem je DNA-polymerasa, která syntetizuje nové vlákno DNA podle původního řetězce. Templátový Řetězec (DNA) T A Tento enzym katalyzuje připojování nukleotidů na 3'-konec rostoucího řetězce DNA za vzniku fosfodiesterové vazby mezi 3'-OH skupinou řetězce a 5'-fosfátovou skupinou přidávaného nukleotidu. A T Nově syntetizovaný Řetězec (DNA) 3'-konec 5'-konec G C DNA je syntetizována ve směru 5' → 3'. Obsah Obr. 4. Vznik fosfodiesterové vazby (1. část) 5'

Obr. 5. Vznik fosfodiesterové vazby (2. část) DNA-polymerasa A G C T 5' 3' Templátový Řetězec (DNA) Nově syntetizovaný Nukleotidy vstupují do reakce jako energeticky bohaté nukleosidtrifosfáty (např. ATP) a dodávají energii polymerizační reakci. DNA-polymerasa se neoodděluje od DNA po každém přidání nukleotidu, ale zůstává navázána na DNA a během polymerace se podél ní pohybuje. Energie uvolněná hydrolýzou jedné fosfodiesterové vazby v nukleosidtrifosfátu je dostatečná pro kondenzační reakci, při které se váže nukleotidový monomer (AMP, TMP, GMP a CMP) do nově syntetizovaného řetězce za současného uvolnění difosfátu. Fosfodiesterová vazba Obsah Obr. 5. Vznik fosfodiesterové vazby (2. část)

Obr. 6. Replikace na vedoucím řetězci DNA-polymerasa Spustit animaci DNA-polymerasa 3' Vedoucí řetězec 5' 5' Animaci spustíte kliknutím na tlačítko Spustit animaci. Nukleosidtrifosfáty (na obrázku znázorněny zeleně) jsou pomocí enzymu DNA-polymerasy připojovány k vedoucímu řetězci (znázorněn oranžově). 3' Nukleosidtrifosfáty (ATP, GTP, TTP a CTP) Obsah Obr. 6. Replikace na vedoucím řetězci

Asymetričnost replikační vidličky DNA-polymerasa je schopna syntetizovat nové vlákno pouze prodlužováním 3'-konce DNA. V replikační vidličce nastává problém, protože původní dvoušroubovice se skládá ze dvou antiparalelních řetězců (je asymetrická). 5' Snímky č. 11 – 15 týkající se asymetričnosti replikační vidličky nejsou vhodné do běžné výuky středoškolské biochemie. Je vhodné je zařadit např. do biochemického semináře. Znázornění antiparalelnosti dvouřetězcové DNA. 3' 3' 5' Obsah Obr. 7. Antiparalelní řetězce DNA

Asymetričnost replikační vidličky Jeden nový řetězec je v replikační vidličce syntetizována podle templátu ve směru 3' → 5'. (Vzniká 5' → 3' řetězec) Druhý nový řetězec je v replikační vidličce syntetizován podle templátu ve směru 5' → 3'. 5' 3' 5' 3' Snímky č. 11 – 15 týkající se asymetričnosti replikační vidličky nejsou vhodné do běžné výuky středoškolské biochemie. Je vhodné je zařadit např. do biochemického semináře. 3' 5' 3' 5' Replikační počátek Obsah Obr. 7. Antiparalelní řetězce DNA

Asymetričnost replikační vidličky Jeden nový řetězec je v replikační vidličce syntetizována podle templátu ve směru 3' → 5'. (Vzniká 5' → 3' řetězec) Druhý nový řetězec je v replikační vidličce syntetizován podle templátu ve směru 5' → 3'. 3' Vedoucí řetězec 5' 5' Snímky č. 11 – 15 týkající se asymetričnosti replikační vidličky nejsou vhodné do běžné výuky středoškolské biochemie. Je vhodné je zařadit např. do biochemického semináře. Pomocí šipek je znázorněn průběh procesu replikace. 3' Obr. 8. Směry replikace 5' 3' 3' Váznoucí řetězec Obsah 5'

Asymetričnost replikační vidličky Neexistuje DNA-polymerasa, která by dokázala prodlužovat 5'-konec DNA. Tudíž v tomto směru roste diskontinuálně tzn., že jsou ve směru 5' → 3' syntetizovány krátké úseky DNA (Okazakiho fragmenty), které jsou následně spojovány v kontinuální řetězec. Řetězec, který je tvořen kontinuálně, se nazývá vedoucí řetězec. Snímky č. 11 – 15 týkající se asymetričnosti replikační vidličky nejsou vhodné do běžné výuky středoškolské biochemie. Je vhodné je zařadit např. do biochemického semináře. Řetězec, který je tvořen diskontinuálně, se nazývá opožďující se nebo váznoucí řetězec. Obsah

Asymetričnost replikační vidličky Vedoucí řetězec Váznoucí řetězec 5' 3' 5' 3' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 5' Okazakiho fragmenty Temlát pro syntézu nového řetězce DNA Směr pohybu replikační vidličky 5' 3' nejnověji nasyntetizovaná DNA Obsah Obr. 9. Asymetričnost replikační vidličky

Korektorská schopnost DNA-polymerázy Před přidáním nového nukleotidu do řetězce, DNA-polymerasa zkontroluje, zda se předcházející nukleotid správně páruje s nukleotidem v templátu. Pokud ANO – přidá další nukleotid. Pokud NE – odstraní nepárující se nukleotid rozštěpením fosfodiesterové vazby a přidá jiný nukleotid. Není vhodné pro střední školy. Proč je DNA-polymerasa velice přesně párující enzym? Proto DNA-polymerasa je velice přesně párující enzym, který udělá průměrně jednu chybu na 107 zreplikovaných párů bází. Obsah

Primasa Obsah DNA-polymerasa neumí začít syntetizovat nové vlákno. Existuje jiný enzym - primasa, která dokáže spojit dva volné nukleotidy. (Začátek syntézy nového vlákna podle jednořetězcové DNA.) Primasa nesyntetizuje DNA, ale krátké úseky RNA majících cca 10 nukleotidů. Tyto úseky se párují na základě komplementarity s templátovým řetězcem a poskytují 3'-konec pro DNA polymerasu. Slouží tedy jako primer pro syntézu DNA. Snímky č. 17 – 18 týkající se enzymu primasy nejsou vhodné do běžné výuky středoškolské biochemie. Je vhodné je zařadit např. do biochemického semináře. Při syntéze vedoucího řetězce je třeba pouze jeden RNA-primer. Syntéza opožďujícího se řetězce je však diskontinuální a vyžaduje neustále tvorbu RNA-primerů. Obsah

Obr. 10. Replikace na váznoucím řetězci (1. část) Primasa Spustit animaci 1. Primasa 2. DNA-polymerasa 5' 3' Snímky č. 17 – 18 týkající se enzymu primasy nejsou vhodné do běžné výuky středoškolské biochemie. Je vhodné je zařadit např. do biochemického semináře. Animace se spustí po kliknutí na tlačítko Spustit animaci. Animace zobrazuje replikaci na váznoucím řetězci. Enzym primasa nejprve nasyntetizuje krátké úseky RNA (přiblližně 10 nukleotidů dlouhé), poté enzym DNA-polymerasa připojuje k těmto primerům správné nukleosidtrifosfáty (ATP, CTP, GTP a TTP). Pro syntézu vedoucího řetězce je třeba pouze jeden primer, kdežto syntéza váznoucího řetězce vyžaduje neustále tvorbu RNA-primerů. 3' 5' Váznoucí řetězec Okazakiho fragmenty Obsah Obsah Obr. 10. Replikace na váznoucím řetězci (1. část)

Okazakiho fragmenty Obsah Opožďující řetězec je tvořen mnoha oddělenými úseky tzv. Okazakiho fragmenty. Na vytvoření souvislého vlákna DNA z Okazakiho fragmentů jsou třeba tři enzymy: 1. Nukleasa – odstraňuje RNA primery; Snímky č. 19 – 20 týkající se Okazakiho fragmentů nejsou vhodné do běžné výuky středoškolské biochemie. Je vhodné je zařadit např. do biochemického semináře. 2. Opravná DNA-polymerasa – nahrazuje RNA-primery DNA; 3. DNA-ligasa – pospojí všechny úseky dohromady. Obsah

Obr. 11. Replikace na váznoucím řetězci (2. část) Okazakiho fragmenty 3' Spustit animaci Vedoucí řetězec 5' 5' 1. Nukleasa 2. Opravná DNA-polymerasa 3' 3. DNA-ligasa 5' Snímky č. 19 – 20 týkající se Okazakiho fragmentů nejsou vhodné do běžné výuky středoškolské biochemie. Je vhodné je zařadit např. do biochemického semináře. Animace se spustí po kliknutí na tlačítko Spustit animaci. Nukleasa odstraňuje RNA primery (na snímku jsou RNA primery znázorněny fialově). Opravná DNA-polymerasa tyto primery nahradí DNA. DNA-ligasa spojí 5´-fosfátový konec prvního úseku s 3´-hydroxylovým koncem druhého úseku (znázorněno modrou vazbou). 3' Váznoucí řetězec 3' 5' Obsah Obr. 11. Replikace na váznoucím řetězci (2. část)

Replikační aparát Obsah Replikace DNA vyžaduje spolupráci několika druhů enzymů. Replikační aparát umožňuje vznik a posun replikační vidličky a syntézu nové DNA. Obr. 12. Replikační aparát 5' 3' Rodičovská DNA Vedoucí řetězec Váznoucí řetězec Vazebný protein pro udržení jednořetězcové struktury Primasa DNA-helikasa DNA-polymerasa Svírací protein Nově syntetizovaný řetězec RNA-primer Nový Okazakiho fragment Okazakiho fragment Jeden z možných modelů replikační vidličky. Předpokládá se však, že obě dvě DNA-polymerasy pracují jako multimerní komplex, tzn. že váznoucí řetězec je stočen tak, aby DNA-polymerasy mohly být v kontaktu. Obsah

Replikační aparát - helikasa (rozvíjí dvoušroubovicovou strukturu) Enzym helikasa se pohybuje podél DNA a současně rozvíjí dvoušroubovicovou strukturu DNA. Na jedořetězcovou DNA nasedají SSB-proteiny (single-strand binding proteins), které ochraňují DNA před znovuspárováním. Obsah Obr. 13. Rozvíjení dvoušroubovicové struktury

Replikace je proces semikonzervativní 5' 3' 3' 5' Replikace DNA je semikonzervativní, protože výsledkem replikace jsou dvě dceřinné dvoušroubovice, z nichž každá má jedno vlákno původní (mateřské – znázorněno oranžově) a jedno nově nasyntetizované (znázorněno modře a zeleně). 3' 5' 5' 3' Obsah Obr. 14. Dceřinná vlákna DNA

Animace pro zopakování Obsah

Replikace na vedoucím řetězci Spustit animaci DNA-polymerasa 3' Vedoucí řetězec 5' 5' Animace se spustí po kliknutí na tlačítko Spustit animaci. Znázornění připojování nukleosidtrifosfátu k vedoucímu řetězci. Enzym katalyzující tuto reakci se nazývá DNA-polymerasa. 3' Nukleosidtrifosfáty (ATP, GTP, TTP a CTP) Obsah

Replikace na váznoucím řetězci (1. část) Spustit animaci 1. Primasa 2. DNA-polymerasa 5' 3' Animace se spustí po kliknutí na tlačítko Spustit animaci. Animace zobrazuje replikaci na váznoucím řetězci. Enzym primasa nejprve nasyntetizuje krátké úseky RNA (přiblližně 10 nukleotidů dlouhé), poté enzym DNA-polymerasa připojuje k těmto primerům správné nukleosidtrifosfáty (ATP, CTP, GTP a TTP). Pro syntézu vedoucího řetězce je třeba pouze jeden primer, kdežto syntéza váznoucího řetězce vyžaduje neustále tvorbu RNA-primerů. 3' 5' Váznoucí řetězec Okazakiho fragmenty Obsah

Replikace na váznoucím řetězci (2. část) Spustit animaci 3' Vedoucí řetězec 5' 5' 1. Nukleasa 2. Opravná DNA-polymerasa 3' 3. DNA-ligasa Animace se spustí po kliknutí na tlačítko Spustit animaci. Nukleasa odstraňuje RNA primery (na snímku jsou RNA primery znázorněny fialově). Opravná DNA-polymerasa tyto primery nahradí DNA. DNA-ligasa spojí 5´-fosfátový konec prvního úseku s 3´-hydroxylovým koncem druhého úseku (znázorněno modrou vazbou). 5' 3' 3' Váznoucí řetězec Obsah 5'

Průběh replikace Obsah 3' Vedoucí řetězec 5' 5' 3' 5' 3' 3' Pomocí šipek je znázorněn průběh procesu replikace. 3' Váznoucí řetězec 5' Obsah

Použitá literatura Obsah [1] ALBERTS, B. a kol. Základy buněčné biologie. Ústí nad Labem: Espero Publishing, 1997. [2] NEČAS, O. a kol. Obecná biologie pro lékařské fakulty. Jinočany: Nakladateství H&H, 2000. [3] KUBIŠTA, V. Buněčné základy životních dějů. Praha: Scientia, 1998. Obsah