Syntéza na pevné fázi – kombinatoriální chemie Miroslav Havránek RE&D VÚFB, s.r.o.

Princip syntézy na pevné fázi

Kombinatoriální chemie 20 aminokyselin x 30 prim. aminů x 30 sec. aminů = látek

Kombinanoriální syntéza Paralelní syntéza „Split and pool“ „Tea bags“ metoda

Paralelní syntéza Geysenova pinová aparatura na syntézu peptidů Aparatura S.H.DeWitt

„Split-and-pool“ syntéza 9 reakcí, 27 látek

Screening: dekonvoluce Testují se směsi Tato směs je aktivní Nová syntéza Tato směs je aktivní Aktivní látka je BA

„One-bead-one-compound“ Firma Selectide (Arizona) Na jedné kuličce je jen jedna látka Knihovna hexapeptidů = členů 1 g polymeru ~ kuliček 3 kopie knihovny (pro knihovnu látek použít kuliček) 95% pravděpodobnost že směs obsahuje určitou látku Screening na pevné fázi: Kulička s aktivní sekvencí se testem zbarví, sekvence se stanoví např. Edmanovým odbouráváním

Testování v roztoku Multicleavable linker – postupné uvolňování z resinu

Tea bags Richard A. Hougten Trega Biosciences : První 2-3 randomizace v T- bag, poslední v 96-well plate (paralelně)

Počátky kombinatoriální syntézy malých organických molekul

Ellmanova syntéza benzodiazepinů Bunin, B. A.; Ellman, J.A. J.Am. Chem. Soc. 1992, 114, 10997

Aminobenzofenony Aminokyseliny Alkylhalogenidy Celkem 192 látek 28 látek – kontrola HPLC/MS 20 látek – stanoven výtěžek (~86%) Kontrola ee čistoty Screening: CCK A receptor radioligandová assay Stavební bloky

Syntéza hydantoinů a benzodiazepinů S.H.DeWitt DeWitt, S. H.; Kiely, J. S.; Stankovic, C. J.; Schroeder, M. C.; Cody, D. M. R.; Pavia, M. R. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.1993, 90, 6909 Hydantoiny: 8 AA, 5 izokyanátů Benzodiazepiny: 8 AA, 5 aminobenzofenon iminů Monitorování 13 C NMR

Zuckermanova syntéza peptoidů -stavební bloky: aminy (velká diverzita, komerčně dostupné) -horší výtěžky a čistota -velký nadbytek činidla -dlouhá reakční doba -stavební bloky: N-substituované Gly (nutno syntetizovat) -dobré výtěžky, čistota, možnost monitorovat průběh reakce (chloranil test) -krátká reakční doba Zuckerman, R. N.; Kerr, J. M.; Kent, S. B. H.; Moos, W. H. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114,

Plánování kombinatoriální syntézy

Resin PS Polystyren zesíťovaný divinylbenzenem Bobtná v DMF, NMP, DMSO,THF, DCM málo v MeOH, EtOH Loading mmol/g PEG-PS Tentagel, Argogel, Novasyn TG Bobtná i ve vodě Loading mmol/g Je dražší 1 kulička: 130  m, loading 0.3 nmol kuliček v 1 g 1 mmol/g... 12% fenylů funkcionalizováno

Linker HAL Linker (0.1% TFA v DCM) Sasrin linker (1% TFA v DCM) Wang resin (TFA-DCM 1:1) Stabilní v TFA, štěpí se HF HMBA linker, štěpí se nukleofilně (působením aminu vznikne amid)

Rink amide linker – štěpení TFA Fotolabilní linker Safety-catch linker

Reakce – syntetická sekvence Byla reakce již prováděna na pevné fázi? Promyšlení sekvence – orthogonalita chránících skupin a linkeru Odzkoušení sekvence na modelové látce – jednoduché stavební bloky, vývoj reakčních podmínek - HPLC/ MS Odzkoušení jednotlivých stavebních bloků, úprava reakčních podmínek Syntéza modelové knihovny, HPLC/ MS Syntéza konečné knihovny, HPLC/ MS části knihovny

Monitorování průběhu reakce Barevný test:- ninhydrinový kaiser test - chloranilový test - na OH, CHO (moc nefungují) IČ spektra: přímo na resinu, vymizení-vznik píku NMR – Tentagel, magic angle spinning, 13 C, 19 F HPLC/MS – odebrat část vzorku, odštěpit, změřit

Syntéza diketopiperazinů

Syntéza pyridinů Hantzschova syntéza pyridinu Gordeev, M. F.; Patel, D. V.; Gordon, E. M. J. Org. Chem. 1996, 61, 924

Tadesse, S.; Bhandari, A.; Gallop, M. A. J. Comb. Chem. 1999, 1, 185

Syntéza močovin

Stavební bloky Diverzní knihovna Nediverzní knihovna variovatelné skupiny scafold

Kombinatoriální chemie ve farmaceutickém průmyslu Každá společnost zabývající se drug discovery Většinou paralelní syntézy, někdy paralelní chromatografie všech členů knihovny HTS: miniaturizace, robotizace, fluorescenční assaye (až vzorků denně) Tradiční přístup Combichem Slouč. na 1 chemika měsíčně Cena$30 000$ Cena za látku $7 500$12 GlaxoSmithKline v roce 2000: 50% „drug leads“ objeveno komb. chemií

Nové protiplísňové látky: substituované imidazoly Saha, A. K.; Liu, L.; Simoneaux, R. L.; Kukla, M. J.; Marichal, P.; Odds, F. Bioorg. Med. Che,. Lett. 2000, 10, 2175

Saha, A. K.; Liu, L,; Marichal, P.; Odds, F. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, 10, 2735

Nature Product-Like Libraries Diversity Oriented Synthesis

Molekulární sondy Taxol: aktivuje samovolné uspřádávání tubulinů do mikrotubulí Rapamycin: Objev immunophilinu FKBP12, sensoru FRAP Tyto „nízkomolekulární“ látky ovlivňují proteiny. Tak můžeme sledovat úlohu proteinu v organismu.

Chemická genetika GEN ProteinEfekt Mutace Genetický přístup Molekula Chemicko-genetický přístup Mnoho proteinů lze ovlivnit malými molekulami. Zmíněné přírodní látky fungují jako molekulární sondy – vedou k objevu nových proteinů, nových mechanismů účinku. Screeningem mnoha látek tak můžeme najít nové molekulární sondy, prostředky k systematickému prozkoumávání biologických procesů. Organická syntéza tak může být základem nových objevů v biochemii.

Diversitně orientovaná syntéza „Target oriented synthesis“: konkrétní cíl (protein) „Diversity oriented synthesis“ : není určen cíl Velká diverzita, komplexní struktura (různé scafoldy) Sloučeniny připomínají svou strukturou přírodní látky (nature-product-like)

Knihovna látek Tan, D. S.; Foley, M. A.; Stockwell, B. R.; Shair, M. D.; Schreiber, S. L. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 9073

Testovací knihovna (8 směsí po 64 látkách) Testováno na různé cíle: - Rapamycin-based growth inhibitor - Modulation of cyclin B degradation - Mink cell line proliferation  aktivuje TGF-  -responsive reporter gene Dekonvoluce, identifikace aktivních struktur Zopakováno na kódované split-pool knihovně látek

Syntetizována 1 kopie knihovny – teoreticky 2946 látek Distribuováno do 384 well plates, uvolněno HF MS: Nalezeno 2527 látek (86%) – zásobní roztok pro screening Galathamine-like library Galathamine

Screening - phenotyp assay Specifický modulátor transportu proteinů z Golgiho aparátu, jeden z 2800 Galathamine-like library Screening na celých buňkách, monitorování transportu proteinu Schreiber: C&EN News, 2003, 3, 51 Ovlivňuje kardiovaskulární systém během vývoje Dánia pruhovaného, jeden z Knihovna biarylů Screening na embrya Dánia pruhovaného

Protein binding assay

Jiné kombinatorální syntézy Fluorous phase Syntéza na PEG rozpustném nosiči –Nízký loading Syntézy v roztoku –Multikomponentní reakce (Ugiho reakce) –Reagenty a scavenger resiny

Závěr Syntéza na pevné fázi - standardní metodika Paralelní syntéza, split-pool knihovny Komerční dostupnost stavebních bloků, reagentů, resinů, pipetorů, robotů... Kombinatoriální chemie v roztoku + na pevné fázi – high-throughput purifikace Výrazné zrychlení vývoje v drug-discovery, katalýze, (materiálové a supramolekulární chemii?), Objevy nových mechanismů v biochemii