Behaviorální metody v neurovědách RNDr.Karel Valeš, PhD. RNDr. Štěpán Kubík, PhD. Laboratoř Neurofyziologie paměti Fyziologický ústav Akademie věd ČR, v.v.i.

Fyziologie chování Registrace motorického a sociálního projevu, sledování elektrofyziologických parametrů Odvození a vysvětlení určitého chování lab. zvířete Cílené ovlivnění chování zvířete (poškození, droga atd.) Korelace s projevy chování u člověka Nalezení vhodného léku, objasnit patofyziologii daného onemocnění

Proč studovat chování? Etologie – zabývá se chováním zvířat – „zvířecí psychologie“ Zvířatům nelze dát dotazník, místo toho je třeba ke zjištění jejich schopností použít vhodný behaviorální test. Chování: Vrozené – instinkty, reflexy Přímo spojené se sebezáchovou či rozmnožováním Získané – různé formy učení od jednoduchých – habituace, klasické podmiňování po komplexní – operantní, prostorové a kontextuální úlohy

Chování Souhrn reakcí, kterými subjekt přistupuje ke skutečnostem jež ho obklopují Chování závisí na : Pohnutkách, motivaci a instinktivních vzorcích chování Emočním stavu jedince Schopností reagovat na skutečnost na základě předchozí zkušenosti

Metodické přístupy ke studiu chování u laboratorních zvířat

Základní okruhy chování studované v laboratorních podmínkách Senzorimotorické zpracování (sensorimotor gating) – především reflexy a jejich modifikace Spontánní aktivita, lokomoce a explorace Emocionalita, zvláště úzkost (anxiety) Učení a paměť – řada podtypů Sociální chování a interakce Tyto přístupy jsou využívány v kombinaci s chirurgickými, farmakologickými, genetickými, elektrofyziologickými, biochemickými či molekulárně biologickými technikami k testování hypotéz o vztahu mezi nervovou činností a chováním.

Senzorimotorické zpracování – test prepulzní inhibice úlekové reakce Sensorimotor gating – prepulse inhibition of (acoustic) startle response - PPI Slabší podnět zeslabuje úlekovou odpověď na následný (silnější) podnět. zpravidla zvukový, ale funguje i taktilní či zrakový Je měřítkem adaptace, její deficit naznačuje neschopnost filtrovat irelevantní podněty a je jedním z markerů schizofrenie. Samotná úleková odpověď na stimulus je reflexní a vyjadřuje celkovou aktivaci organismu – tato úleková reakce je zvýšena např. u PTSD Apatura testu prepulzní inhibice úlekové odpovědi

Senzorimotorické zpracování – test prepulzní inhibice úlekové reakce Sensorimotor gating – prepulse inhibition of (acoustic) startle response - PPI Interval cca 30-480 ms, nad 500 ms dochází k prepulzní facilitaci (PPF) - zvýšení odpovědi na podnět – patrně díky zvýšené pozornosti Jako podnět se zpravidla používá krátká salva bílého šumu (white noise). Inhibice dosahuje u zdravých lidí až 70 %. Muži mají větší PPI. Nevědomý fenomén (velmi krátký interval) nezávislý na učení či podmiňování (objevuje se napoprvé) Léze či inaktivace některých mozkových struktur narušují PPI. Aplikace dopaminových, serotoninových 5-HT2 a NMDA antagonistů narušuje PPI stejně jako některé vývojové změny (mateřská deprivace nebo izolovaný chov). PPI se hojně využívá při studiu animálních modelů schizofrenie, např. látky, které obnovují narušenou PPI v animálních modelech, mohou být dále testovány na jejich antipsychotickou účinnost. Další testy na senzorimotorické zpracování – rotarod, tilted platform test, simple reaction time test – odpověd na podnět.

Spontánní aktivita zvířat - Open Field Zvíře (potkan) umístěný do neznámého prostředí jej začne spontánně a aktivně prozkoumávat (explorace), což se projeví zvýšenou lokomocí (přemísťování) a orientačním chováním (čichání, panáčkování). Zvýšená úzkost (anxiety) se může projevit snížením explorace a thigmotaxí – preferencí stěn. Horizontální aktivita – lokomoce, thigmotaxe Vertikální aktivita – panáčkování Grooming – osobní hygiena, je „opakem“ explorace – naznačuje známost prostředí. Freezing – kompletní absence pohybu kromě dýchání – odráží strach Další – čichání, popř i stereotypické chování po aplikace látek-např amfetaminu, wet dog shakes – automatismus přítomný u animálních modelů epilepsie

Spontánní aktivita zvířat - Open Field Opakovaným testem v témž prostředí lze testovat habituaci (zvyknutí). Rozmístěním objektů lze testovat rozpoznání objektu (object recognition task). Konflikt motivací – explorace vs. strach z neznámého (neofobie). Úroveň lokomoční a vertikální aktivity je měřítkem celkové behaviorální aktivace. Hyperaktivita – často pozorována po aplikaci agonistů dopaminových receptorů – amfetamin, stimulační drogy Hyperlokomoce navozená antagonisty NMDA receptorů (PCP, MK-801) – význam při modelování schizofrenie – považována s jistými omezením za analogii pozitivních příznaků psychózy – souvisí s nadměrnou funkcí dopaminergního systému v mesolimbickém okruhu Stereotypické chování, např po apomorfinu, či vysokých dávkách stimulantů Po senzitizaci D2 receptorů chronickou aplikací D2 agonisty quinpirolu během ontogeneze potkani rituálně explorují některé objekty, rigidně se drží určitých tras používá se jako model obsedantně-kompulzivní poruchy (OCD). Aplikace anxiolytik (BZD) snižuje thigmotaxi - snížená úzkost z nového prostředí Test otevřeného pole je velmi citlivý na látky snižující aktivitu – např. antagonisté dopaminových a adrenergních receptorů

Testování emocionality a úzkosti Úzkost (anxiety) je z emocionálních funkcí nejpřístupnější objektivnímu měření Hyponeofagie označuje nechuť pozřít větší množství neznámé potravy. Anhedonie se testuje jako absence přirozené preference pro sladký roztok např. u animálních modelů afektivních poruch (model deprese indukovaný chronickým mírným stresem). Ukázka testu hyponeofagie

Testy emocionality Konfliktní test: potkani mačkají páčku  odměněny potravou  elektrická rána  navození úzkosti Podmíněné emocionální odpovědi: strnutí při bolestivém podnětu (freezing) strachem zesílená úleková reakce (asociace světla s bolestivým podnětem, poté se ke světlu přidá silný akustický podnět  zesílení úlekové reakce)

Testy emocionality Pasivní a aktivní vyhýbání: trestání po výskytu zvířete v jeho přirozeném prostředí Podmíněná ultrazvuková vokalizace: u potkana frekvence 20-22 Hz je zesilována s nepříznivým stimulem, ukazatelem strachu zvířete Vyvýšené křížové bludiště: (elaveted plus maze)

Vyvýšené křížové bludiště Elevated Plus Maze - EPM Počet vstupů do otevřených ramen a celkový čas strávený v otevřených ramenech jsou nepřímo úměrné míře úzkosti. Benzodiazepiny (pozitivní allost.modulátory GABA-A) zvyšují dobu strávenou v otevřených ramenech. Některé jiné léky, klinicky používané ke zmírnění úzkosti (např. SSRI) nevykazují v tomto testu příliš silné výsledky.

Další testy úzkosti Zero maze – cirkulární bludiště – analogie s EPM Tail suspension test – jednoduchý, často užíván u myší při sceeningu antidepresiv Myš je 6 min pověšena za ocásek a monitoruje se imobilita x snaha o vyproštění – antidepresiva snižují imobilitu, ale také stimulancia, BZD naopak nehybnost zvyšují. Forced swim – využíván rovnež při studiu stresu a jeho vlivu na paměť a v animálních modelech afektivních poruch Zero maze – cirkulární bludiště – analogie s EPM

Modely sociálního konfliktu Sledování interakce mezi izolovaně chovaným jedincem a neagresivním samce chovaným skupinově Antipredátorové modely Vyhýbaní se predátorům, testy obranného chování, úzkostného chování

Obranné chování Potkanem výhoda = přirozený objekt Robotem nevýhoda = nepředpověditelný pohyb Robotem výhoda = možnost definované rychlosti a trajektorie nevýhoda = arteficiální objekt Umělým ježkem

Paměť a učení Pamě't z hlediska neurofyziologie: Modifikace chování na základě předchozí zkušenosti Učení je proces, kterým měníme nervový systém a tím i chování. Tyto změny chápeme jako paměťovou stopu. Informace nejsou tedy "skladovány", ale spíše mění způsob vnímání, myšlení, plánování či konání prostřednictvím strukturálních změn NS.

Paměť a učení Paměť je schopnost organismů ukládat, uchovávat a vybavovat informace Učení je proces ukládání informací do paměti. 3 fáze paměti: Učení (learning, encoding, acquisition) Získání, zpracování a syntéza informace Uchování (storage, retention) tvorba trvalého záznamu informace – engram) Vybavení (retrieval, recall, recollection) vyvolání uložené informace a její použití, verbalizací nebo změnou chování

Adaptivní význam paměti Paměť umožňuje adaptivní změnu chování na základě zkušenosti – předvídání následků. Zvířata vnímají podněty jako žádoucí (apetitivní), nežádoucí (averzivní) a neutrální podle toho, jak jsou jim užitečné (potrava) nebo nebezpečné (elektrický šok) a podle toho je vyhledávají (preference) nebo se jim vyhýbají (avoidance – vyhýbání) Zapomínání je ztráta paměti Vyhasínání (extinction) není zapomínání, je to nové učení, kdy původní paměťová stopa není vymazána, ale modifikována. Modifikace chování má svůj základ v plastických změnách v činnosti nervových spojů (synaptické plasticitě), které vedou ke změnám signalizace. Tento pohled je důležitý proto, že současná koncepce paměti pokládá právě synaptickou plasticitu a molekulární změny s ní spojené za hlavní mechanismus uchování informace v mozku, a zároveň kriticky ukazuje důležitost studia chování (jak jinak bychom se dozvěděli, že zvíře se něco učí?)

Paměť a učení Mechanismem učení a paměťi je změna účinnosti synaptického přenosu informace mezi neurony – synaptická plasticita. Konsolidace paměti – proces během kterého se zpočátku krátkodobá, labilní paměťová stopa transformuje v trvanlivější dlouhodobý záznam. Klasifikace paměti: Podle doby trvání Percepční (senzorická) Krátkodobá (někdy pracovní) Dlouhodobá (referenční) Podle typu informace Nedeklarativní (implicitní) – neasociativní i asociativní, priming, sensorické i motorické dovednosti. Deklarativní (explicitní) – verbalizovatelná Sémantická Epizodická

Krátkodobá a pracovní paměť V řádu vteřin až minut – trvá do přerušení – odevedení pozornosti Úlohy pracovní paměti (zpravidla u člověka nebo primátů) zahrnují aktivní monitorování a manipulaci s informacemi nebo typy chování. Reprezentace podnětu po dobu jeho přítomnosti až do okamžiku odpovědi Paměť pro podnět, objekt nebo místo udržovaná v rámci sezení (within-session) ale ne mezi sezeními (between-session) Spontánní alternace v Y-bludišti, radiální bludiště, varianta vodního bludiště Léze nebo funkční vyřazení (inaktivace) prefrontálního kortexu (PFC) u zvířat vede k narušení pracovní paměti.

Dlouhodobá paměť Long-term memory - LTM Minuty až celý život (desítky let). Ukládá se prostřednictvím změn v synaptické plasticitě, tedy ve změnách účinnosti synaptického přenosu. Při konsolidaci dlouhodobé paměti hraje důležitou roli spánek – deprivace vede k narušení dlouhodobé paměti.

Klasifikace dlouhodobé paměti podle typu informace Nedeklarativní – implicitní paměť Neasociativní učení – habituace, senzitizace Asociativní učení – klasické a operantní podmiňování Procedurální učení – motorické dovednosti Deklarativní – explicitní paměť Sémantická (fakta, události) Epizodická paměť (autobiografická, zážitky) Jako-epizodická (co, kde, kdy – u zvířat)

Nedeklarativní, implicitní paměť Neasociativní - reflexy, habituace, senzitizace - je přítomen pouze 1 podnět a nechochází tedy k žádné asociaci. Asociativní – asociace nepodmíněného podnětu (např. el. ranka nebo potrava s podmíněným podnětem, např. tón či světelný podnět Klasické podmiňování (průkopníkem I.P. Pavlov) – nevyžaduje po zvířeti žádnou volní akci Operantní podmiňování – (Skinner)- zvíře se naučí vykonávat určitou činost (mačkat páčku) aby dosáhlo odměny nebo se vyhnulo trestu (předvídání důsledků svých akcí) Procedurální učení (motor skills) – tréninkem získané dovednosti, které nemusíme vybavovat vědomě (jízda na kole, lyžích, hra na hudební nástroj) U zvířat i u člověka jsou především závislé na bazálních gangliích a mozečku

Asociativní učení Při operantním podmiňování se zvíře učí vykonávat nějakou činnost aby dosáhlo odměny (apetitivní) nebo se vyhnulo trestu (averzivní). Zvíře musí „předvídat“ důsledky svého jednání. Při klasickém podmiňování dochází ke spárování nepodmíněného podnětu s podmíněným, který pak je sám o sobě schopen vyvolat behaviorální odpověď.

Deklarativní, explicitní paměť Verbalizovatelná (vědomá) paměť pro fakta, události a zážitky Sémantická – fakta nezávislá na místním a časovém kontextu („Hlavním městem Francie je Paříž“) Epizodická – konkrétní události v kontextu spojené se sebeuvědoměním („Včera jsme dali s Frantou U Stromu osm piv a cestou domů se najednou zvednul chodník a dal mi do držky“) Episodic-like – paměť pro co?, kdy?, kde? u zvířat, kde nelze posoudit sebeuvědomění Autobiografická paměť umožňuje vnitřní cestování v čase. Single-trial learning jako model epizodické paměti Prostorová paměť – nejpřístupnější model deklarativní paměti u zvířat Kritickou strukturou je hipokampus ve spolupráci s neokortexem Poškození hipokampu vede k anterográdní a částečně retrográdní amnézii - pacient H.M. Pacienti bez hipokampu mají též omezenou schopnost imaginace nových situací. Poškození hipokampu u zvířat vede k poruše prostorového chování.

Hipokampus - klíčová struktura pro prostorovou paměť u zvířat a deklarativní paměť u lidí Strukturně jednodušší mozek Absence rýhování hemisfér koncového mozku, Poměrně značnou část potkaního mozku zabírají hipokampus a čichové laloky Hipokampus inervován především z mediálního septa (Ach, GABA) a entorhinální kůry (Glu)

Deklarativní paměť u zvířat Prostorová paměť – specifický typ deklarativní paměti Clayton a Dickinson v roce 1998 ukázali, že sojky západní (western scrub jays), které mají ve zvyku si uschovávat potravu v různých skrýších si prokazatelně pamatují druh potravy (co?), místo skrýše (kde?) a dobu uschování (kdy?). „Vědomá“ komponenta však u zvířat není přístupná a hovoříme tedy o jako-epizodické paměti (episodic-like memory) obsahující „co?“, „kde?“ a „kdy?“ komponenty. Tento výzkum ukazuje, že řadu „vyšších nervových funkcí “ lze studovat na vhodných zvířecích modelech.

Paměť a učení Změna chování vyvolaná individuální zkušeností subjektu V nejjednodušším případě opakovanou expozicí určité situaci nebo podnětu - habituace) Speciální typ chování s vysokou adaptivní hodnotou Vybrané testy učení a paměti: Fear Conditioning - strachové podmiňování Active Avoidance – aktivní vyhýbání Passive Avoidance – pasivní vyhýbání Taste Memory – především podmíněná chuťová averze Object recognition task – rozpoznání objektu Spontaneous Alternation – test pracovní paměti Spatial tests: Morris Water Maze, Radial Arm Maze, Barnes Maze

Strachové podmiňování Fear conditioning Zvíře je umístěno do kontextu (skinnerův box), kde dostane jeden nebo více elektrických šoků (nepodmíněný podnět), kterým případně předchází prezentace podmíněného podnětu (tón, světlo). Při příští expozici kontextu (contextual fear conditioning) nebo podmíněného podnětu (cue fear conditioning) projevuje zvíře strach, který se zpravidla měří jako ataxie – freezing. Kontextuální, nikoli klasické podmiňování závisí na hipokampu, v obou je rozhodující vliv amygdaly. Single-trial learning Auditory fear conditioning – pavlovovské Kontextuální strachové podmiňování

Aktivní a pasivní vyhýbání Pasivní (passive, inhibitory avoidance IA) -vyhnutí se trestu potlačením přirozené tendence nebo chování Step-through Step-down Aktivní – vyhnutí se trestu aktivním vykonáním nějaké aktivity One-way active avoidance Two-way shuttle box Vodní verze aktivního vyhýbání určená pro studium chování akvarijních rybek

Podmíněná chuťová averze Conditioned taste aversion Paměťová stopa CTA je udržována proteinkinázou Mzeta v insulární kůře - její blokáda zde vede k vymazání této paměti. Shema R, Sacktor TC, Dudai Y. (2007) Rapid erasure of long-term memory associations in the cortex by an inhibitor of PKM zeta.Science Aug 17;317(5840):951-3. Zvířeti je nabídnuta nová chuť (potrava, ochucená voda) a následně způsobena silná nevolnost například podáním LiCl. Zvíře následně novou chuť odmítá – conditioned taste aversion (CTA). Jedná se o formu klasického (pavlovovského) podmiňování - asociace podmíněného podnětu (určité chuti) s nepodmíněným nevolností), která vede k vyhýbání se této chuti. Tato paměťová stopa se může vytvořit i v bezvědomí (při silné otravě) a může perzistovat po VELMI dlouhou dobu – je to vysoce adaptivní učení. Funguje též u lidí - někdo nepije rum, někdo zelenou, podle toho, na co si vytvořil(a) chuťovou averzi. CTA je kriticky závislá na parabrachiálním jádře (hlubokém jádru spodního mozku) a insulárním kortexu (obsahuje korovou oblast pro zpracování chuťových vjemů), amygdale, supramammillárním jádře, nucleus accumbens.

Úloha rozpoznávání objektu Object recognition task sample choice Tato úloha je založena na spontánní tendenci prozkoumávat nové věci a má dvě fáze: sample – prezentace objektů choice – volba nového objektu Zvíře rozpozná známý objekt tím, že jej kontaktuje, očichává a prozkoumává méně než ten nový. Modeluje prvky semantické paměti – není třeba si pamatovat kontext. Signifikantní preference pro nový objekt po 4, ale ne 24 hodinách.

Prostorové úlohy „Y“, „T“ a křížové bludiště Radiální bludiště (radial arm maze) Morrisovo vodní bludiště Bludiště Barnesové Úlohy vyhýbání se místu Prostorová paměť (spatial memory) umožňuje navigaci k cílům, jež nejsou přímo perceptibilní s využitím vzdálených orientačních bodů (alothetická navigace), a integrace vlastního pohybu z výchozího bodu (idiothetická orientace, path integration). Předpokládá vytvoření kognitivní mapy prostředí Model deklarativní paměti Je kriticky závislá na hipokampu, ale v její funkci hraje roli i entorinální kůra (hlavní aferentní struktura), popř. také prefrontální (PFC) a posteriorní parietální kůra (PPC).

Deklarativní paměť u zvířat Neurony v hippokampu s lokálně-specifickou aktivitou (place cells), aktivují se jen pokud je zvíře v preferenčním místě Neurony směru hlavy, aktivují se pouze pokud se zvíře dívá určitým specifickým směrem

Kognitivní mapa Registr obsahující informace o prostorovém rozložení orientačních bodů v prostředí a informace o poloze subjektu, dovolující subjektu vybrat nejkratší možnou dráhu mezi startem a cílem; zároveň dovoluje generovat „shortcut“ .

Místové neurony (place cells) v hipokampu Pyramidové neurony v CA1 a CA3 oblastech hipokampu (O’Keefe and Dostrovsky, 1971) Nahrávány in vivo extracelulárně vykazují prostorově specifickou aktivitu

Prostorová navigace (základní členění) Navigace vzhledem k přímo perceptibilním cílům – např.viditelným-kognitivně méně náročná Navigace ke skrytým cílům, jejichž polohu lze určit pouze nepřímo (place navigation) –vyžaduje jistou formu abstrakce

Základní typy orientace Alotetická - na základě prostorových vztahů okolních orientačních bodů - „kognitivní mapa“-hipokampus (?), posteriorní parietální kortex Idiotetická - integrace informací o pohybu a poloze těla přicházející z vnitřních senzorů- hipokampus – mediální entorinální kortex (?)

Spontánní alternace Vrozené chování, ale k jeho vyjádření může dojít až v průběhu ontogeneze Bylo popsáno i u dětí, kdy u 6-měsíčních nebylo ještě plně vyjádřeno (často se vracely do stejného ramene), zatímco u jednoročních již ano. Snad zvláštní forma exploračního chování, v přírodě zřejmě velmi univerzální (ukázáno u trepky Paramecium i lidských spermií v „mikrobludištích“). Dosavadní vysvětlení tohoto „jednoduchého jevu“ jsou zatím nedostatečná. Často je používána jako test pracovní paměti (zvíře si musí pamatovat které rameno navštívilo naposledy), vyžaduje také pozornost. Citlivá k lézi mPFC, také bazolatelární amygdaly (BLA , intezivně spojená s PFC), v některých případech může být poškozena i po rozsáhlejších lézích hipokampu. Spontánní alternace (SAB - Spontaneous Alternation Behavior)

Radiální bludiště (Radial Arm Maze) Úkolem je navštívit všechna ramena, kde je potrava, a vyhnout se opakování Dva druhy chyb: Reference memory error – návštěva ramene kde potrava nikdy nebyla Working memory error – opakovaná návštěva Závisí na hipokampu je-li poloha odměňovaných ramen určena prostorovými vztahy k okolním orientačním bodům Working memory Reference memory

Morrisovo vodní bludiště (Morris water maze – MWM) Vyvinuto skotským badatelem Richardem G. Morrisem, publikováno poprvé v r. 1981, od té doby se stalo klasikou všech paměťářů. Výhodou je eliminace povrchových (čichových) orientačních bodů, zvíře se orientuje téměř výhradně podle vzdálených orientačních bodů. Učení se měří latencí nalezení ostrůvku. Vybavení paměti se testuje ve zkušební plavbě (probe swim) bez ostrůvku – porovnává se čas strávený v jednotlivých kvadrantech. Varianta s viditelným ostrůvkem slouží jako kontrola senzorikých a motorických schopností. Zvíře vypouštěné z náhodných míst na periferii bazénku musí najít skrytý ostrůvek umístěný zpravidla ve středu jednoho z kvadrantů. Zvířata musí nejprve překonat přirozenou snahu najít únik na periferii bazénku a naučit se hledat ostrůvek. Posléze se naučí plavat přímo k ostrůvku.

Morrisovo vodní bludiště (Morris water maze – MWM) Léze hipokampu způsobí těžký deficit v MWM. Složitým tréninkem lze naučit vyhledávat skrytý ostrůvek i potkany bez hipokampu, ale naučí se hledání, nikoli konkrétní lokaci ostrůvku.

Delayed matching-to-place Test pracovní paměti -delayed matching to place (DMP) – 4 plavby denně, poloha ostrůvku se mění každý den – vysoce závislá na hipokampu i po předtrénování. Klíčovou je druhá plavba (která následuje s různě dlouhým ostupem po první plavbě), kdy se měří čas potřebný k nalezení ostrůvku Steele RJ, Morris RG. Delay-dependent impairment of a matching-to-place task with chronic and intrahippocampal infusion of the NMDA-antagonist D-AP5. Hippocampus. 1999;9(2):118-36.

Vyhýbání se místu (place avoidance) Zvíře se pohybuje po aréně s uniformním povrchem a musí se vyhýbat neoznačené oblasti, jejíž návštěva je potrestána mírnou elektrickou rankou. Oblast může být definována v souřadnicovém systému místnosti (room frame) nebo arény (arena frame).

Aktivní alotetické vyhýbání se místu (Active Allothetic Place Avoidance - AAPA) Potkan na rotující aréně se musí vyhýbat sektoru definovanému v souřadnicích místnosti. Zvířata musejí rozlišit mezi orientačními body na aréně a v místnosti a vybrat souřadnicový rámec místnosti jako relevantní pro navigaci - kromě prostorové navigace vyžaduje i tzv. „kognitivní koordinaci“. Úloha je citlivá i k jednostranné inaktivaci hipokampu (větší nárok na integritu hipokampu. Tato úloha modeluje reálné situace, kdy je třeba rozlišovat více simultánních referenčních rámců, např. vůči zdroji potravy a zároveň vzhledem k predátorovi.

Aktivní alotetické vyhýbání se místu Ukázky trajektorií poškozeného a nepoškozeného potkana Nalevo – hyperlokomoce + neschopnost řešit úlohu video laskavě zapůjčeno A.A. Fentonem, SUNY - N.Y.

Dvojité vyhýbání (double avoidance) Potkan je trénován vyhýbat se místu stabilnímu v místnosti a zároveň místu na rotující aréně. Klement, 2005 video laskavě zapůjčeno A.A. Fentonem, SUNY - N.Y.

Blue Velvet Arena Zařízení pro testování prostorové paměti u lidí.

Neurobiologie paměti Změny chování jakožto projevy učení mají původ ve změnách nervové aktivity. Kandidátním mechanismem těchto změn je synaptická plasticita – změna učinnosti synaptického přenosu. Typy plasticity: Neasociativní paired-pulse facilitation post-tetanic potentiation Asociativní (hebbovská) short-term potentiation LTP - long-term potentiation LTD - long-term depression

Neurobiologie paměti Fáze formování pam. stopy: zpracování stimulů formování krátkodobé pam. stopy (nevyžaduje proteosyntézu) formování a konsolidace dlouhodobé pam. stopy (vyžaduje proteosyntézu) vybavení informace rekonsolidace

Neurochemie paměti Konsolidace pam. stopy je závislá na proteosyntéze Konsolidovaná stopa je stabilní a odolná vůči poškození Nicméně během vybavení se stává opět labilní a její rekonsolidace vyžaduje opět proteosyntézu

Neurochemie paměti V současnosti nejakceptovanější pohled na formování paměťové stopy je založen na trvalé strukturální reorganizaci na synaptické úrovni, doprovázené syntézou nových proteinů. Krátkodobá plasticita je pravděpodobně zprostředkována post-translační modifikaci proteinů a jejich dynamickém přeskupení.

Neurochemie paměti Většina dat je založena na behaviorálních testech, LTP, studiu neuroplasticity u nižších živočichů (Aplysia).

Neurochemie paměti

Neurochemie paměti Glutamát Glutamát jako hlavní excitační neuropřenašeč – informační zpracování – blokáda GluR vede ke zhoršení prostorové orientace i k narušení stability místových neuronů

Neurochemie paměti

Neurochemie paměti Model inserce nových AMPA receptorů do postsynaptické membrány během LTP Lisman a Zhabotinsky 2001

Neurochemie paměti Role glutamátu NMDA receptory hrají roli v indukci LTP AMPA receptory v hrají roli v průběhu LTP Podobně: Aplikace NMDA antagonistů narušuje formování pam. stopy, nikoliv však její vybavení v MWM. Naproti tomu AMPA antagonisté narušují oba procesy.

Neurochemie paměti Kandel 2001

Neurochemie paměti Izquierdo a kol. 2006 Časový průběh molekulárních změn v hippokampu během konsolidace paměťové stopy

Neurochemie paměti Sorra a kol. 1998

Neurochemie paměti Cattabeni a kol. 1999

Neurochemie paměti Williams and Castner, 2005

LTP (long-term potentiation) Dlouhodobá potenciace Bliss and Lømo (1973) J. Physiol. 232: 331-356 - první popis LTP v gyrus dentatus králíka

LTP (long-term potentiation) Dlouhodobá potenciace Časná fáze – early LTP nezávislá na proteosyntéze Indukce LTP Pozdní fáze – late LTP závisí na syntéze nových bílkovin a remodelaci synapse Udržování LTP In vitro In vivo In behaving animals In hippocampus (PPDG, Schaffer collateralsCA1) Ekvivalenty LTP v různých oblastech mají jiné charakteristiky a jiné mechanismy (mossy fibersCA3)

LTP (long-term potentiation) Dlouhodobá potenciace ALE! – LTP zůstává artefaktem simultánní stimulace mnoha nervových vláken a za fyziologických podmínek k takové aktivaci nedochází! Nicméně proces změny účinnosti jednotlivých synapsí je zřejmě podstatou jak učení, tak populačních jevů jako LTP a LTD. Řada zjištění ukazuje na úzké spojení mezi mechanismy LTP a učením, ale kontroverzní místa zůstávají – efekt pretréninku.

Blokáda LTP ovlivňuje učení Studie R. Morrise a kolegů ukázala, že po aplikaci antagonisty NMDA receptorů, látky D,L-AP5, došlo jak k zablokování indukce LTP tak nechopnosti učení ve vodním bludišti Vidíte, že potkani, jimž byl aplikován D,L-AP5 hledali během probe trialu ostrůvek víceméně náhodně, na rozdíl od situace po aplikaci L-AP5 – neaktivní izomer. Blokáda učení pomocí AP5 však nemusel znamenat kauzální vztah mezi LTP a učením; je možné, že pouze dochází k zablokování nějakých společných mechanismů, popř jinému mechanismu.

Saturace LTP poškozuje učení Původní studie Mosera et al. ukázala, že pokud byli potkani tetanizováni na většině synapsí v hipokampu, tzn. došlo k saturaci LTP, poškodilo to učení a paměť. To naznačuje vztah mezi LTP a učením. Je tu však velké ALE. Tito potkani nebyli před saturací LTP obeznámeni s pravidly úlohy. Moser et al., 1998

Intaktní předtrénování pravidlům úlohy odstraní negativní vliv saturace LTP na učení Pokud zvířata podstoupí před saturací LTP tzv. NSP (non-spatial pretraining; neprostorové předtrénování), deficit vzniklý saturací LTP vymizí. Indukce LTP tedy v tomto případě spíše zodpovídá za procedurální aspekt úlohy – to je právě ten, který si zvířata osvojí během NSP NSP zpravidla realizováno tréninkem potkanů v bazénu bez orientačních bodů (záclona), přičemž poloha ostrůvku se náhodně mění. Zvířata se tedy naučí pravidla úlohy, tzn. že je třeba hledat ostrůvek, že thigmotaxe nikam nevede, pouze se nenaučí, KDE ostrůvek je.

Zvířata vykazují podobné prvky chování jako lidé Zvířata vykazují podobné prvky chování jako lidé. Je tedy možné aby zvířata měla psychické poruchy podobným těm u člověka ?

Význam animálních modelů v psychiatrii ne plně zrcadlit lidskou patologii dané nemoci, ale najít určitou shodu mezi symptomy lidského onemocnění a změnami u zvířat na různých úrovních zkoumání Fce animálních modelů objasnění základních neurálních mechanismů jednotlivých chorob vývoj nových léčebných postupů

Laboratorní zvířata Používaná laboratorní zvířata: opice (Maccac rhesus), psi (modely deprese, depresivní plemena psů),potkani (výrazné sociální chování, dobrá paměť, rychlá ontogeneze), myši (studium agresivity, závislosti, časté genetické modely, velký počet potomků) Alternativní přístup: použití buněčných kultur (primárně také ze zvířat), počítačových sítí, pokusy na dobrovolnících

Validita animálních modelů konstruktivní validita: testují teorie a hypotézy vzniku daného onemocnění, vyjadřují shodu mezi teorií a výsledky získanými experimentem a jejich korelaci s projevy daného onemocnění. fenomenologická validita: určuje shodu mezi projevem zvířete v daném modelu se symptomy modelovaného onemocnění. prediktivní validita: schopnost modelu předpovídat vybrané vlastnosti u lidí, predikce účinnosti nových léků.

Validita - platnost modelu Určit nakolik model skutečně odpovídá projevu daného onemocnění Rozlišovací validita: specificita modelu pro dané onemocnění Konvergentní validita: míru shody mezi různými modely stejného onemocnění Spolehlivost modelu: do jaké míry je použití určitého modelu reprodukovatelné.

Schizofrenie Schizofrenie je považovaná za komplexní onemocnění mozku, postihující kognitivní a emoční funkce Pozitivní symptomy: zhoršují běžné funkce mozku (halucinace, bludy, stereotypie) Negativní symptomy: svědčí pro ztrátu normální funkce mozku (anhedonie, sociální a citové ztažení).

Deficit kognitivních funkcí u schizofrenie Pozornost: deficit jednoduchých pozornostních funkcí,pomalejší zpracování smyslových vjemů,neschopnost udržet pozornost, zvýšená pohotovost k rozptylování, poruchy selektivní pozornosti Pracovní paměť Verbální vybavování Vizuální vybavování Exekutivní Funkce: horší kontrola pozornosti,nedostatečná schopnost plánování,obtíže v řešení problémů,narušení sociálního úsudku a náhledu,obtíže v řízení emočních a volních složek Motorické schopnosti Rodriguez

Animální modely schizofrenie PŘÍZNAKY SCHIZOFRENIE SCHIZOFRENII-PODOBNÉ CHOVÁNÍ Pozitivní příznaky hyperlokomoce Stereotypie stereotypie Vulnerabilita na stres stresová hyperlokomoce a Deficit ve zpracování deficit v PPI informací Kognitivní deficit zhoršení prostorové a pracovní paměti Sociální deficit redukce sociálního kontaktu Bubeníková et al. 2003

Etiologie schizofrenie DNA vir toxiny výživa porodní komplikace   PATOFYZIOLOGIE: Anatomické a funkční poškození v neuronální konektivitě komunikaci  Zhoršení kognitivních procesů SYMPTOMY SCHIZOFRENIE (halucinace, disorganizovaná mluva, negativní symptomy) Andreasen 2001

Modely schizofrenie s konstruktivní validitou Neurovývojové modely: experimentálního poškození mozku v prenatálním nebo perinatálním období navození schizofrenii-podobného chování Malnutriční model (prenatální proteinová deprivace) Virová infekce v prenatálním období (virus chřipky, Borna virus) Těhotenské a porodní komplikace Maternální separace

Genetické modely schizofrenie Transgenní modely: knock-out nebo knockdown myši DA transporter (DAT-KO): hyperlokomoce, stereotypie, PPI, LI, paměť D3 + D1: hyperaktivta (Gainetdinov a Caron, 2001) Glu NMDA receptory: Knockdown NR1 podjednotky (NR1-KD) (Mohn, 1999) Knock-out NR2A podjednotky (Miyamoto,201)

Modely schizofrenie s fenomenologickou validitou Látka Symptomy Neurobiologie Animální model pozitivní negativní Atropin Skopolamin +++ delirantní stav s halucinacemi amnézie + - antagonismus Ach receptorů potkani - testy učení a paměti Amfetamin ++ psychomotorický neklid poruchy myšlení + sociální izolace nepřímý agonismus DA receptorů potkani – stereotypie perseverace agregace myší-  LD50 LSD +++ Halucinatorní stav bez poruchy vědomí + stažení do sebe agonizmus 5-HT2 receptorů potkani stereotypie (třes hlavy) PCP, MK-801, Ketamin +++ delirantní stav s halucinacemi poruchy paměti ++ autismus Emoční oploštění nebo indiference antagonismus NMDA receptorů potkani - stereotypie testy učení a paměti

MK-801 – nekompetitivní antagonista NMDA receptorů Systémová aplikace MK-801 – animalní model schizofrenie s vysokou fenomenologickou a predikční validitou Hyperlokomoce – analog positivních symptomů (způsobených hyperdopaminergní aktivitou v mesolimbických strukturách) Stereotypní chování Deficit in sensomotorických funkcích Narušení pracovní paměti Redukce sociálního chování

Ukázka chování po podání MK-801 Control MK-801

Ilustrace dráhy „psychotického“ (A) a kontrolního (B) zvířete

Děkuji za pozornost