Chemismotický tok protonů BEN - chemi Chemismotický tok protonů 4.ročník - bioenergetika

Centrální koncept bioenergetiky BEN - chemi

Otevřený obvod BEN - chemi Nulový proud Maximální napětí (potenciál)

Uzavřený obvod průchod proudu = dýchání BEN - chemi průchod proudu = dýchání konání užitečné práce = syntéza ATP

Zkratovaný obvod rozptyl energie ve formě tepla BEN - chemi rozptyl energie ve formě tepla nízký potenciál x nejintezivnější dýchání

Respirační řetězec MTCH BEN - chemi

Rozdělení p na pH a  BEN - chemi Faktory při ustavení protonového gradientu na membráně: a) nízká elektrická kapacita MTCh membrány * přenos 1nmol H+  potenciál 200mV b) pufrovací kapacita matrix * cca 20nmol H+ na mg proteinu na jednotku pH * ztráta 1nmol H+  nárůst pH pouze o 0,05 jedn. Vliv permeabilních látek: Kationty – redistribuce  na pH (průchod K+ snižuje p a to je kompenzováno dalším přenosem H+ = zvýšení gradientu pH) Slabé kyseliny – zrušení pH gradientu a obnovení  * může vést k bobtnání MTCH x neprobíhá v přítomnosti Ca2+ a Pi

Rozdělení p na pH a  Zvýšení podílu pH po přidání K+ a ionoforu BEN - chemi Zvýšení podílu pH po přidání K+ a ionoforu

Určení stechiometrie H+/0 BEN - chemi Extrapolace na hodnotu bez průsaku H+ membránou během aerobní fáze Pulsní kyslíková metoda: přídavek malého množství O2 k anaerobní suspenzi MTCH – sledování změny pH rychlou elektrodou

Stechiometrie H+/ATP BEN - chemi Stechiometrie H+/ATP - přímo ze struktury F1.F0 ATP synthasy * na 1 otočku katalytické jednotky F1 3 moly ATP * rotor poháněný H+ vyžaduje 10-14 H+ na 1 otočku tj. odhad poměru 3,3 - 4,7 H+/ ATP - musí souhlasit s TD výpočty z G a p: * exp.hodnoty p ~ 170-200mV odpovídají poměru 3-4 Podmínka shody mezi stechiometrií dýchacího řetězce, ATP syntézy a celkové stechiometrie ATP synthesy: ATP/ 2e- = { H+/2e- } { H+/ATP } ATP/ O = {H+/O } { H+/ATP } …. O2 jako finální akceptor

Respirační kontrola transportu H+ BEN - chemi „Protonový proud“ JH+ = { O/t } { H+/0 } * přímá úměrnost spotřebě kyslíku * pohodlné určení kyslíkovou elektrodou (Clark ) * jednoduchý model sledování respirační kontroly Podle inkubačních podmínek můžeme sledovat: a) transport substrátu přes membránu b) aktivitu dehydrogenasy pro přísl. substrát c) aktivitu dýchacího řetězce d) transport adeninových nukleotidů e) aktivitu ATP synthasy f) permeabilitu membrány pro H+

Protonový proud a respirační kontrola BEN - chemi Inhibice transportního proteinu ( pro sukcinát) b) Inhibice dehydrogenasy c) Inhibice dýchacího řetězce

Protonový proud a respirační kontrola 2 BEN - chemi d) Inhibice transportu adeninových nukleotidů e) Inhibice ATP synthasy

Respirační stavy MTCh Konvence sledu respiračních stavů MTCH BEN - chemi Konvence sledu respiračních stavů MTCH (typický experiment): stav 1: pouze MTCH ( v přítomnosti Pi) stav 2: přídavek substrátu (nízká respirace – málo ADP) stav 3: přídavek ADP (rychlá respirace) stav 4: konec přeměny ADP na ATP (zpomalení respirace) stav 5: anoxie (dnes se běžně používají pouze označení stav 3 a 4)

Respirační stavy a poměr P/O BEN - chemi p

Protonová vodivost Protonová konduktance membrány CM H+ = JH+ /p BEN - chemi Protonová konduktance membrány CM H+ = JH+ /p * ústřední parametr chování daného MTCh preparátu Příklad: jaterní MTCh ve stavu 4 – oxidace sukcinátu 1) Typické hodnoty: 15 nmol 02 min-1mg-1, p = 220mV, H+/O = 6 2) Po přidání ionoforu FCCP - pokles p na 40mV, nárůst respirace na 100nmol O2

Protonová vodivost Protonová konduktance membrány CM H+ = JH+ /p BEN - chemi Protonová konduktance membrány CM H+ = JH+ /p * ústřední parametr chování daného MTCh preparátu Příklad: jaterní MTCh ve stavu 4 – oxidace sukcinátu 1) Typické hodnoty: 15 nmol 02 min-1mg-1, p = 220mV, H+/O = 6 JH+ = 15 x 6 = 90 nmol H+ min-1 mg-1 2) Po přidání ionoforu FCCP - pokles p na 40mV, nárůst respirace na 100nmol O2

Protonová vodivost Protonová konduktance membrány CM H+ = JH+ /p BEN - chemi Protonová konduktance membrány CM H+ = JH+ /p * ústřední parametr chování daného MTCh preparátu Příklad: jaterní MTCh ve stavu 4 – oxidace sukcinátu 1) Typické hodnoty: 15 nmol 02 min-1mg-1, p = 220mV, H+/O = 6 JH+ = 15 x 6 = 90 nmol H+ min-1 mg-1 CMH+ = 90/220 = 0,41 nmol H+ min-1 mg-1 mV-1 2) Po přidání ionoforu FCCP - pokles p na 40mV, nárůst respirace na 100nmol O2

Protonová vodivost Protonová konduktance membrány CM H+ = JH+ /p BEN - chemi Protonová konduktance membrány CM H+ = JH+ /p * ústřední parametr chování daného MTCh preparátu Příklad: jaterní MTCh ve stavu 4 – oxidace sukcinátu 1) Typické hodnoty: 15 nmol 02 min-1mg-1, p = 220mV, H+/O = 6 JH+ = 15 x 6 = 90 nmol H+ min-1 mg-1 CMH+ = 90/220 = 0,41 nmol H+ min-1 mg-1 mV-1 2) Po přidání ionoforu FCCP - pokles p na 40mV, nárůst respirace na 100nmol O2 J H+ = 100 x 6 = 600 nmol H+ min-1 mg-1 C MH+ = 600/40 = 15 nmol H+ min-1 mg-1 mV-1

Svalová termogeneze Hnědá tuková tkáň B) netřesová (non-shivering) BEN - chemi Svalová termogeneze A) třesová B) netřesová (non-shivering) * tetanické stahy svalů (včely, čmeláci) * plíce soba – spalování tuků * hnědá tuková tkáň (0.5% hmotnosti x 10-nás. respirace) * hibernace (malí a velcí savci) * novorozenci (termoregulace) * dospělý člověk

Zimní spánek a hnědá tuková tkáň BEN - chemi

BAT (hnědá tuková tkáň)

Fyziologická kontrola hnědé tkáně BEN - chemi Fyziologická kontrola hnědé tkáně UCP uncoupling protein změna konformace po vazbě mastné kys. vysoká koncentrace po narození lze indukovat adaptací na chlad nebo přejídáním

Fyziologická kontrola hnědé tkáně BEN - chemi Reakční cela se třemi elektrodami pro měření , respirace, JH+ a CMH+

Fyziologická kontrola BAT BEN - chemi Funkce UCP1

Fyziologická kontrola BAT BEN - chemi Hypotetická role UCP2 a UCP3: obrana proti ROS

Přehled významu UCP BEN - chemi

Bazální průsak protonů BEN - chemi Mechanismus: - není vázán na přítomnost nějakého specifického proteinu - nesouvisí s fosfolipidovým složením membrány - pravděpodobný průsak na spojích mezi proteiny a lipidy ? Fyziologický význam: - bazální metabolismus svalové tkáně - průsak je nejvyšší při vysokém p * mohl se vyvinout jako mechanismus limitující max. napětí * omezení vzniku ROS a oxidativního poškození ?

Celkové parametry přeměny energie BEN - chemi Koeficient respirační kontroly - empirický parametr ~ integrita MTCH - poměr respirace při max. a nulové syntéze ATP (typicky 3-15) - u baktérii nízká respirační kontrola Koeficient P/O = mol ATP na 2e- proteklé určitou částí řetězce - pokud je použit jiný terminální akceptor – koef. P/2e- - měřeno po malém přídavku ADP k MTCH ve stavu 4 - je výsledkem hodnot H+/2e- a H+/ATP pro daný substrát a zúčastněné respirační komplexy Přibližné hodnoty: NADH-O2 P/O = 2,5 sukcinát-O2 P/O = 1,5

Uměle vyvolaná protonmotivní síla BEN - chemi Experiment „kyselé lázně“: Inkubace thylakoidů ve tmě a pH 4 Přenos do pH 8 Syntéza ATP ! Považováno za důkaz že pH je schopno pohánět syntézu ATP x uplatňuje se i  (permeabilita pro sukcinát a tvorba difúzního potenciálu)

Princip „kyselé lázně“ BEN - chemi - Pro podobný experiment s MTCH nebo bakteriemi je potřeba ionofor pro kompenzaci náboje

Rekonstituce protonového obvodu BEN - chemi světlem-poháněna protonová pumpa

Příště: BEN - chemi „Dýchací řetězec“