Imunologické laboratorní metody Průtoková cytometrie Princip průtokové cytometrie Použití více fluorescenčních barev - teorie kompenzace Možnosti analýzy dat Některé aplikace průtokové cytometrie Imunologické laboratorní metody 12.4.2010

Průtokový cytometr = „Automatický mikroskop“ Průtoková cytometrie je technologie, která umožňuje simultánní měření několika charakteristik na úrovni jedné buňky Detekce & Počítání Buňky prochází před objektivem mikroskopu a je automaticky změřena jejich fluorescence. Nevýhody oproti mikroskopii: nevíme, kde je v buňce signál lokalizován Odpad Vzorek

Složky průtokového cytometru Fluidika: vzorek – buněčná suspenze. Nasátí vzorku do přístroje. Průtok vzorku přístrojem. Vytvoření proudu buněk pro měření. Sortování. Regulace rychlosti měření. Optika: Zdroj excitačního záření. Optické zařízení pro sběr emitovaného záření a odraženého světla. Zdroje světla (lasery, detektory, filtry) Elektronika: Převod optického signálu na elektronický signál. Digitalizace pro počítačovou analýzu. Analýza dat: Zobrazení dat & analýza identifikace populací kvantifikace intenzity značení kvantifikace zastoupení buněk v dané populaci

Schéma fluidiky Unášecí tekutina Odpad Natlakování Vakuum Tlak Vzorku (Variabilní) Tlak unáš. tek. (Stálý) vzorek

Princip průtokové cytometrie Jádro průtokového cytometru: Flow cell - kyveta Nasátí buněk Quartz nozzle Fluorescenční signály Laserový paprsek Velikost otvoru v nozzle = 50 to 400 µm - na některých přístrojích lze měnit

Hydrodynamická fokusace v kyvetě Dobré rozlišení Horší rozlišení Vzorek Vzorek Unášecí tekutina Unášecí tekutina Nízký tlak vzorku,úzký proud vzorku Vhodné pro DNA analýzu Vysoký tlak vzorku, široký proud vzorku. Nevhodné pro DNA analýzu nízký vysoký 1

Rozptyl světla buňkou: Forward Scatter (FSC) Čím větší buňka, tím větší rozptyl světla FSC závisí na velikosti buňky Laserový paprsek FSC Detektor

Rozptyl světla buňkou: Side Scatter (SSC) Laserový paprsek FSC Detektor Sběrné čočky Intenzita SSC je proporcionální množství cytosolických struktur v buňce (granula, buněčné inkluze, atd.) SSC závisí na granularitě buňky SSC Detektor

Rozdělení krevních buněk dle FSC a SSC Lymfocyty Granulocyty Monocyty Erytrocyty debris, Mrtvé buňky

Detekce fluorescence, značení protilátkami

Intenzita fluorescence Relativní intenzita fluorescence FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC Počet buněk FITC FITC 101 102 103 104 Relativní intenzita fluorescence 6

Fluorescenční kanály Stokesův posun Fluorochromy (buňce vlastní nebo navázané, např. pomocí protilátek) na buňkách absorbují část světla a excitují se Emise světla o nižší energii, tj. o delší vlnové délce než byla excitační. Emitované fotony prochází přes sběrné čočky a jsou pomocí soustavy filtrů a zrcadel rozděleny do kanálů dle svojí vlnové délky Stokesův posun

Lasery Light amplification by stimulated emission of radiation Zdroj monochromatického světla (jediná vlnová délka) Zdroj koherentního vlnění = vlnění o stejné frekvenci, stejného směru kmitání a stejné fáze (nebo se stejným fázovým rozdílem). Stabilní zdroj záření . Lasery v průtokovém cytometru: Dvoulaserové průtokové cytometry argon laser - modrý (488 nm) helium-neon diode laser - červený (633 nm). Třílaserové průtokové cytometry violet laser - fialový (407 nm) nebo UV laser (350 nm)

Detekce Fluorescence Laser Beam FSC Detector Collection Lens Emitovaná fluorescence je pomocí sestavy filtrů a čoček rozdělena podle vlnové délky do kanálů. Na koncových detektorech je v každém z nich vyhodnocena intenzita fluorescence. Fluorescence Detector A, B, C, etc…

Intenzita fluorescence Relative fluorescence intensity FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC Number of Events FITC FITC 101 102 103 104 Relative fluorescence intensity 6

Long Pass Filtry (LP) Propouští všechny vlnové délky vyšší než specifikovaná vlnová délka Example: 500LP bude propouštět všechny vlnové délky větší než 500nm 400nm 500nm 600nm 700nm Transmittance

Short Pass Filtry (SP) Propouští všechny vlnové délky kratší než specifikovaná vlnová délka Příklad: 600SP bude propouštět všechny vlnové délky kratší než 500nm. 400nm 500nm 600nm 700nm Transmittance

Pásmové filtry Propouší specifické rozmezí vlnových délek Příklad: 550/20BP Filter bude propouštět vlnové délky mezi 540nm a 560nm (550/20 = 550+/-10, ne 550+/-20) 400nm 500nm 600nm 700nm Transmittance

Dichroické filtry Mohou být long pass (LP) nebo short pass (SP) Filtr je umístěn v úhlu 45° Část světla je odražena v úhlu 90º k příchozímu paprsku, část světla je propuštena. . Dichroic Filter Detector 1 Detector 2

Jednoduché schéma optiky přístroje Počet kanálů: 2 lasery – obvykle 4 kanály 3 lasery – až 11 kanálů FITC PE APC PC5

Vícebarevná průtoková cytometrie FACS Aria

Vícebarevná průtoková cytometrie FITC PE APC PC7 PC5 Pacific blue

Elektronika Detektory PMT (photomultiplier tube): elektrony dopadají na fotokatodu Lze měnit napětí na PMT – lze nastavit citlivost detektoru Konverze optického signálu do elektronických signálů (změny v napětí - pulsy) Amplifikace signálu a digitalizace (Analog to Digital Converters = ADC ). Analýza výšky Height (H), šířky Width (W) a plochy Area (A) pulsu Softwarová analýza dat – LIST MODE FILE: pro každou buňku hodnoty všech parametrů 8

Vznik pulsu napětí na PMT Laser t Voltage 1. 2. 3. Voltage 9

Výška, šířka a plocha pulsu Plochy pulsu (A) Výška pulsu (H) Napětí 40 Šířka pulsu (W) čas (µs) 12

Práh (Threshold) Hodnota treshold definuje minální intenzitu signálu v daném kanálu, která je zaznamenáno. Nižší signály nejsou zobrazeny ani zaznamenány. 13

Kompenzace Fluorochromy typicky emitují světlo v širokém spektru vlnových délek (100nm nebo víc) V závislosti na uspořádání filtrů, detektory mohou zachytit fluorescenci od jiných fluorochromů, které jsou detekovány v jiných kanálech kanálů (tzv. přesvit, překryv spekter) Přesvit je třeba „kompenzovat“, tak aby detektor zaznamenal signál pouze 1 fluorochromu

Excitační a emisní spektra fluorochromů (modrý laser) Stejná excitace různá emise Překryv spekter (overlap)

Překryv spekter (spektral overlap) FITC Fluorescein Isothiocyanate PE Phycoerytrin

Kompenzace Jednobarevné značení CD8 FITC FL2-%FL1=0% FL2-%FL1=12% Jde pouze o výpočet, úpravu dat, tak aby byla analyzovatelná Závisí na: nastavení přístroje (PMT napětí na detektorech) vlastnostech dané šarže fluorochromu

Kompenzace pomocí softwaru Je potřeba připravit jednobarevně značené kontrolní vzorky Software vypočítá hodnoty kompenzací Snadné, přesné a rychlé Umožňuje to mnohobarevnou analýzu Možné na cytometrech nové generace Kompenzační matrix FL1 FL2 FL3 FL1 Comp 3.96 FL2 Comp 27.35 5.15 FL3 Comp 11.18

Mnohobarevná cytometrie Výhody Šetří čas a vzorky (1) 6barevná zkumavka = (15) 2barevných zkumavek Exponenciální nárůst informace Data z (1) 6barevné zkumvky » (15) 2barevných zkumavek Identifikace nových/málo zastoupených populací (<0.05%) interní kontroly ve vzorku Problémy Musí se pečlivě zvolit kombinace protilátek a fluorochromů Ne všechny reagencie jsou dostupné ve všech barvách Vyšší možnost vzniku chyb Je potřeba zvolit správné kontroly

Analýza a interpretace dat Data v LIST MODE FILE – pomocí speciálního softwaru grafické zobrazení Různé typy grafů Statistiky Názvy běžných programů (CellQuest, DiVA, Flowjo, WinMDI, FCS Express)

Histogramy – zobrazení 1 parametru LIST MODE FILE Event # Param 1 FSC Param2 SSC Param 3 FITC Param 4 PE Param 5 APC 1 100 500 10 650 4 2 110 505 700 6 3 90 480 720 670 95 490 15 0………10………100………1000…….10000 Četnost (count) Intenzita signálu

Dot ploty – zobrazení 2 parametrů Periferní krev – populace dle velikosti a granularity SSC FSC 30% Periferní krev – populace lymfocytů dle CD4 a CD8 60%

Gatování Populace krevních dendritických buněk Vytvoření statistik pro buňky,které nás zajímají: procento pozitivních buněk Hodnota fluorescence (relativní hodnota) Gate je definován jako oblast Data mohou být zobrazena pouze pro definovaný subset buněk

Hlavní aplikace na průtokovém cytometru: DNA a RNA analýza Analýza životnosti (zastoupení apopt. buněk) Fenotypizace (zastoupení populací, testování aktivace buněk) Funkce buněk (Ca2+influx) Imunologické funkce ( ox. reakce, cytotoxické funkce) Sorting a buněčná izolace

Stanovení zastoupení základních buněčných populací Periferní krev CD4+ Th lymfocyty CD8+ Tc (cytotoxické) lymfocyty CD16+CD56+ NK buňky CD19+ B lymfocyty

Analýza životnosti, apoptózy Apoptóza – fosfatidylserin na vnější straně membrány – vazba Annexinu V Mrtvé buňky Průnik barvy do jádra (PI nebo DAPI)

Analýza buněčného cyklu Events DNA obsah na průtokovém cytometru G1 S phase M G0/1 G1 G2 G2/M 1 2 1 S DNA obsah Rozložení do fází buněčného cyklu

Značení konců DNA dUTP Apoptotické buňky (DNA je fragmentována Apoptóza – fragmentace DNA Na volné konce DNA se enzymaticky naváže [Fluorescein-deoxyuridine triphosphate (dUTP)] Detekce v kanálu FITC Apoptotické buňky (DNA je fragmentována Green Fluorescence Živé buňky (DNA není fragmentována Green Fluorescence

Oxidační reakce Superoxide Hydroethidine Např. Testování funkce makrofágů Oxidací vzniká fluorescenční produkt, který je detekován cytometricky. Superoxide Hydroethidine Hydrogen Peroxide Dichlorofluorescein Glutathione levels Monobromobimane Nitric Oxide Dichlorofluorescein

Influx calcia Stimulace – nespecifická, specifická (receptory) Fluorescence barvičky pouze, pokud váže vápník (Indo-1, Rho-2) Flow Cytometry Image Cytometry 0.8 0.7 0.6 0.5 Ratio: intensity of 460nm / 405nm signals 0.4 0.3 0.2 Stimulation 0.1 36 72 108 144 180 Time (seconds) Time (Seconds) 50 100 150 200

Testování fagocytózy Control 0°C 4 hod 24 hod Pohlcují dendritické buňky (DC) apoptotické nádorové buňky ? Červeně označené nád. buňky, DC označené protilátkou HLA-DR FITC (zelená) Control 0°C 4 hod 24 hod