Systematická toxikologická analýza v urgentních stavech Ing Eva Nováková, CSc

Toxikologická analýza – objektivní průkaz přítomnosti cizorodé látky ve vzorku biologického materiálu - v klinických akutních případech slouží k diferenciální diagnose, v ostatních ke kontrole (užívání terapie, abstinence od drog atd.) - ve forenzních případech jako důkaz v trestně právním řízení - vzhledem k velkému množství možných nox musí být systematická, aby byl získán správný výsledek v relativně krátkém čase

Systematická toxikologická analýza: především analýza kvalitativní zjišťuje, zda je ve vzorku přítomna nějaká cizorodá látka identifikuje ji po identifikaci analýza kvantitativní - stanovení hladiny již známé látky Analýza cílená: zaměřena na průkaz určité látky podle požadavku lékaře - stanovení hladiny alkoholu, karbonylhemoglobinu - průkaz a stanovení hladiny ethylenglykolu - stanovení hladin známých léků při monitorování terapie intoxikace - kontrola vylučování látky identifikované v předchozí analýze

Jednotlivé kroky systematického postupu a analytické metody screening - imunochemické metody - chromatografické metody identifikace - vyhodnocení nálezu stanovení hladin - spektrofotometrické metody

Biologický materiál vhodný pro toxikologickou analýzu - pro screening a identifikaci : moč zvratky,1. porce žaludečního výplachu - pro stanovení hladin : krev (serum, plasma) Screening a identifikace v krvi – pouze není–li jiný materiál k disposici, nutno použít ekonomicky nákladné a časově náročné metody. Hladiny v moči – pouze je- li sbírána 24 hod. nebo je výsledek vztažen na kreatinin - méně obvyklý materiál vhodný pro určité typy vyšetření : vlasy, smolka novorozenců, sliny v případě úmrtí orgány g.i. traktu Vždy je třeba odebrat dostatečné množství vzorku, aby nebylo nutné předčasně analýzu ukončit pro nedostatek materiálu. Doporučovaná množství pro odběr – moč 50 – 100 ml, žaludeční obsah 50 ml, krev ( srážlivá) 2x 10 ml, pro stanovení COHb krev nesrážlivá, citrátová 10 ml. Odběry do vhodných, čistých nádobek – nejlépe sklo, na krev zkumavky BD Vacutainer

Screeningové metody: - imunochemické - jediné metody v toxikologické analýze, které lze provádět přímo ve vzorku moče, krevního sera či plasmy - rychlé, výsledek za 10 – 20 min. - automatizované, měření na analyzátorech - stačí malý objem materiálu ( 100 – 300 μl) - nespecifické, zachycují celou skupinu strukturně podobných látek - slouží k vytřídění pozitivních a negativních vzorků, pozitivní výsledek nutno potvrdit metodou založenou na jiném principu - jsou vyrobeny pouze pro úzký okruh léčiv a drog chromatografické - pro většinu případů - vždy nutná isolace ze vzorku

Chromatografické metody pro screening a identifikaci - chromatografie na tenké vrstvě (TLC) - plynová chromatografie (GC) s různými detektory (FID, ECD,NPD) - plynová chromatografie s detekcí hmotnostní spektrometrií (GC-MS), a tandemovou hmotnostní spektrometrií (GC-MS-MS) - vysoko účinná kapalinová chromatografie (HPLC) se spektrofotometrickým detektorem (UV/VIS) či detektorem diodového pole (DAD ) - kapalinová chromatografie s detekcí hmotnostní spektrometrií (LC-MS) a tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS-MS) Pro screening na léky a drogy používána hlavně metoda TLC a GC-MS, na těkavé látky GC-FID

Isolace z biologického materiálu: Požadavky na isolaci: - pro screening: isolovat co nejvíce neznámých látek ze vzorku - pro cílenou analýzu: isolovat především hledanou látku a co nejmenší množství dalších sloučenin - pro kvantitu: isolační postup s vysokou výtěžností a dobrou reprodukovatelností Provedení isolace: - extrakce kapalina- kapalina ( např. moč- organické rozpouštědlo) - extrakce na pevné fázi ( přes kolonku se sorpčním materiálem, vymytí organickým rozpouštědlem) - extrakce spojená s derivatizací ( především pro GC-MS, např. trimethylsilylderiváty)

Vyhodnocení a interpretace nálezu - je integrální součástí toxikologické analýzy a často je to záležitost velmi obtížná - je třeba vyhodnotit a dát do souvislosti výsledky analýzy několika metod v několika matricích - při tom je třeba vzít v úvahu anamnestické údaje a spolupracovat s ošetřujícím lékařem ( pokud je výsledek analýzy ve výrazném rozporu se zdravotním stavem pacienta, hledat další příčiny, dohodnout se na rozšíření analýz apod.) - odpovídající si nálezy v jednotlivých vzorcích odebraných témuž pacientovi ukazují i na to, že nedošlo ke kontaminaci či záměně materiálu - podaří – li se shromáždit dostatek dat, lze pak z analýzy odhadnout závažnost a časové stadium intoxikace, případně expozici noxám v minulosti

Na následujících obrázcích je zachycena analýza moče z případu z praxe. Jednalo se o podezření na zneužívání heroinu. A) Výsledky imunochemického screeningu v moči: pozitivní záchyt opiátů, kannabinoidů a budivých aminů. B) Analýza metodou TLC ( viz obr. 11) – porovnáním polohy skvrn s polohou standardů – A(atropin) K (kodein) F(fenmetrazin) A(aminophenazon) D(diazepam) a detekce Dragendorffovýn a Marquisovým činidlem – suspektní nález : nikotin, methamphetamin, morfin, kodein?, dihydrokodein ?,hydrocodon? C) K potvrzení opiátů použita GC-MS – provedena izolace s derivatizací ( silylace) obr. 12 záznam chromatografických píků opiátů ze vzorku obr. 13 vybrané hmotnostní spektrum morfinu v silylované formě s typickými hmotami 429, 414 a 401 Závěr: nález : morfin, dihydrokodein, kodein

V případu nebyl prokázán 6 – monoacetylmorfin, který je jednoznačným důkazem aplikace heroinu. Jeho nález je však časově omezen na 8-12 hod. po aplikaci . Methamphetamin byl potvrzen TLC v další mobilní fázi a vedla standardu , prokázán byl i jeho metabolit amphetamin. Také kannabinoidy byly potvrzeny metodou TLC. Závěr : nález v moči- methamphetamin, amphetamin, morfin, kodein, dihydrokodein, kannabinoidy, nikotin. Později bylo zjištěno, že dotzčný pacient bral dihydrokodein jako substituci za heroin