MUTAGENEZE in vitro postupy kterými se mění primární struktura DNA, především za účelem fenotypové změny

Mutace gen mutace mutovaný gen transkripce translace normalní protein normální fenotyp mutovaný gen abnormální protein částečně funkční nefunkční žádný změněný fenotyp

Typy mutací BODOVÉ DELECE INZERCE INVERZE TRANSLOKACE

Mutace na genové úrovni MUTACE SE ZTRÁTOU SMYSLU 5’ ATG GGA GCT CTA TTA ACC TAA 3’ met gly ala leu leu thr stop 5’ ATG GGA GCT CTA TGA ACC TAA 3’ met gly ala leu stop MUTACE BEZ PROJEVU 5’ ATG GGA GCT CTA TTA ACC TAA 3’ met gly ala leu leu thr stop 5’ ATG GGA GCT CTA TTG ACC TAA 3’ ZMĚNA JEDNÉ AMINOKYSELINY 5’ ATG GGA GCT CTA TTA ACC TAA 3’ met gly ala leu leu thr stop 5’ ATG GGA GCT CTA TTT ACC TAA 3’ met gly ala leu phe thr stop MUTACE S POSUNEM ORF 5’ ATG GGA GCT CTA TTA ACC TAA 3’ met gly ala leu leu thr stop 5’ ATG GGG AGC TCT ATT AAC CTA A 3’ met gly ser ser ile asn leu

Mutace na úrovni organismu Letální mutace – organismus umírá v důsledku změněného nebo chybějícího produktu genu. Může být letální na základě okolních podmínek Mutace způsobí pouze částečnou změnu funkce genu (např. snížení aktivity) Mutace genu jehož funkce není pro buňku esenciální nebo může být nahrazená genem podobným (genová rodina) Skrytá mutace (bez efektu)

PSEUDOGENY 1) Procesované (nebo retrotransposované) pseudogeny vznikly reverzní transkripcí z RNA a zabudováním do genomu 2) Neprocesované (nebo duplikované) pseudogeny vznikly duplikací a následnýma spontánníma mutacema 3) Jedinečné pseudogeny jedinečné, důležité v evoluci. např. gulonolakton oxidasa pro biosyntézu vitamínu C

REVERZE Proces kdy mutant získá zpět wild-typový fenotyp, dvě cesty: 1. zpětná mutace (přesná, málo častá) 2. supresorová mutace (mutace na jiném místě genu, která potlačuje (supresuje) původní mutaci. Mutant se nazývá REVERTANT. Je častá u mutací s posunem ORF.

Amesův Test test měří mutagenicitu různých látek jako zvýšenou frekvenci spontánní reverze mutanta his- to his+ POUŽITÍ: testování nových látek na mutagenitu, potravinářská aditiva, pesticidy, kosmetika atd. histidin-vyžadující mutant (his-) Salmonella typhimurium Test chemikálie + bakterie minimální medium bez histidinu 48 hrs Backgroundová spontánní REVERZE Chemicky indukovaná REVERZE

gen rezistence k antibiotiku TRANSPOZOMY mobilní elementy DNA které se pohybují v rámci genomu, s četnosti 10-7 až 10-2 přenosu na generaci. tento přenos je TRANSPOZICE pokud se tento transpozom dostane do genu chová se jako inzertní mutace, s tím že tuto mutaci nelze vrátit zpět reverzí. transpozice je řídký jev, můžeme však do transpozomu vložit gen pro rezistenci k antibiotiku, využívá se při mutaci zprostředkované transpozomem Transpozomy jsou důvodem proč spousta kmenů bakterií v nemocnicích je rezistantní vůči širokému spektru antibiotik. Většina resistence je buď na plasmidech nebo transpozomech, které se mohou mezi jednotlivými kmeny vyměňovat, což je posíleno selekčním tlakem prostředí (spousta antibiotik v nemocnici). Staphylococcus aureus gen rezistence k antibiotiku IS Element

SPONTÁNNÍ MUTACE  FLUKTUAČNÍ TEST mutace je náhodný proces obecně dochází ke spontánní mutaci s pravděpodobnosti 10-6 až 10-9 na gen za jednu generaci každý gen mutuje s jinou pravděpodobností (pozice v genomu) mutace ovlivňující fenotyp je ještě daleko řidší pravděpodobnost reverze je daleko nižší než přímé mutace EVOLUCE letitý spor zda je variabilita mezi organismy způsobena ADAPTACI NA PROSTŘEDÍ nebo SPONTÁNNÍMI MUTACEMI a až zpětnou adaptaci FLUKTUAČNÍ TEST spontánní mutace vznikají chybou v replikaci DNA, 3-5 exonukleasová (PROOF-READING) aktivita DNA polymeras (ne u PCR!) působení fága 1943 

GENETICKÉ MAPOVÁNÍ často používaná metoda pro zjišťování funkce neznámých genů náhodná mutageneze semen Arabidopsis způsobující fenotypovou změnu mutagen ethylmethan sulfonát (EMS), záření rentgenové nebo gamma. 40.000 semen se pěstuje a pozoruje fenotyp - M1 generace, mutace je heterozygotní. M1 generace se samozkříží a semena se seberou. M2 semena se vysejí a mutanti s požadovaným fenotypem identifikují (ti co produkují pouze potomstvo s fenotypem jsou homozygotní na mutaci).

GENETICKÉ MAPOVÁNÍ ? mapa Arabidopsisových molekulárních markerů I 121.4 cM II 99.1 cM III 101.7 cM IV 92.0 cM V 104.0 cM nga 63 nga 126 nga 225 nga 8 nga 151 DET1 G4711 nga 139 mutace a její pozice ? CH42 GPA1 GAPB NIT1 nga 168 nga 280 PRHA DFR I-V 518.2 cM nga 111 mapa Arabidopsisových molekulárních markerů

GENETICKÉ MAPOVÁNÍ mutaci mapujeme pomocí molekulárních markerů u Arabidopsis thaliana ekotyp Columbia další rozšířený ekotyp Arabidopsis thaliana je Landsberg erecta pomocí DNA markerů můžeme rozlišit mezi těmito dvěmi ekotypy existuje na 50.000 sekvenčních polymorfismů mezi ekotypy Landsberg erecta a Columbia a jejich pozice na chromozomech je přesně známa. tyto rozdíly se detekují především pomocí PCR variabilita v rámci inzertů a delecí způsobující rozdílnou délku amplifikovaných fragmentů, nebo vznikem nového restrikčního místa. příklad polymorfismu mezi Landsberg erecta a Columbia – vznik nového restrikčního místa DraI v PCR produktu markeru

crossing over a rekombinace během meiozy při tvorbě gamet u heterozygotů (výměna části chromozomů) x x Strain 1 Columbia mut (-/-) Strain 2 Landsberg mut (+/+) F1 rostliny mut (-/+) BACK CROSSING markery ve vazbě mut { mut (-/-) mut (+/-) F2 semena

četnost genotypu po crossing overu GENETICKÉ MAPOVÁNÍ homozygotní selektovaný mutant ekotypu Columbia homozygotní nemutovaný ekotypu Landsberg erecta heterozygot tzv. BACKCROSSING (zpětné křížení s mutantem) semena v F2 generaci poskytující mutantní fenotyp musí být homozygoti vzniklí crossing overem četný genotyp marker A není ve vazbě s mutaci četnost genotypu po crossing overu vzácný genotyp marker B je ve slabé vazbě s mutaci velmi vzácný genotyp marker C je ve vazbě s mutaci

analýza zpětně zkřížených mutantů frekvence rekombinace (RF) mezi mutovaným lokusem a různými markery RF [%] = # chromozomů Landsberg / # celkový počet chromozomů x 100 čím nižší procento, tím silnější vazba marker I ve vazbě 5 mutantů 1/10x100 = 10% marker II bez vazby na mutaci 6 mutantů 5/12x100 = 58% většinou se analyzuje až 1000 zpětně zkřížených mutantů, ten s nejméně četným genotypem na testovaný marker pro druhý ekotyp má tento marker nejblíže mutaci určení dvou nejbližších markeru a následná sekvenace chromosomu mezi a nalezení hledané mutace resp. genu nesoucího tuto mutaci

GENETICKÉ MAPOVÁNÍ člověk shromážděno největší dostupné množství příslušníků rodin ve kterých se nachází znak (nemoc), kterou chceme mapovat – určit gen, který nemoc způsobuje. Odebrány vzorky krve, izolována DNA a provedeno PCR na zhruba 200 genových markerů - polymorfismů (pokrývající celý genom 7.5 - cM od sebe) nalezen nejbližší marker tzn. jedna forma (alela) se nejčastěji vyskytuje u nemocného a u jeho zdravých sourozenců se nejčastěji vyskytuje druhá forma (marker ve vazbě k mapovanému genu – nejmenší pravděpodobnost crossing overu) 2 kolo – provedeno PCR na další nejbližší markery v nejbližším okolí markeru nalezeného v prvním kole testování. nakonec nalezeny dva nejbližší markery a DNA mezi nimi sekvencována u nemocného jedince a porovnána se zdravým.

GENETICKÉ MAPOVÁNÍ člověk - příklad Geny ve vazbě 2/13 transkripční faktor LMX1B

GENETICKÉ MAPOVÁNÍ myš Inbrední linie myší – homozygotní téměř ve všech lokusech, vzniká křížením sourozenců minimálně po 20 generací

Kongenní myš – vzniklá zpětným křížením potomstva dvou inbredních linií, z niž jedna nesla znak, který chceme alokovat, minimálně přes deset generací a selekcí na sledovaný znak Velikost diferenciálního segmentu v průběhu kongenizace Alokace lokusů pomocí rozdílnosti mikrosatelitních markerů u jednotlivých inbredních myších linií Průměrná vzdálenost u myší – 6.7 cM

MUTACE CÍLENÁ studuje efekt změny v genetickém materiálu - modifikace promotorové sekvence za účelem studia účinnosti transkripce - studium významu jednotlivých AK v proteinu zlepšování kvality např. expresního systému KOZAKOVÁ SEKVENCE je důležitá pro efektivitu translace (umožňuje pevnou vazbu malé ribozomální podjednotky na mRNA) u eukaryot. nebo proteinu, který exprimujeme změna jedné nebo i více aminokyselin může zlepšit kvalitu či aktivitu léčiva (enzymu) -6 -5 -4 -3 -2 -1 start codon +4 +5 +6 Kozak seq. U A A A C A A U G G C U 60% 100% 70% AtCKX1 G U A G A A A U G G G A AtCKX2 A A A C A A A U G G C U HvCKX2 A G A G C C A U G A G G

mutace místně cílená (site-directed mutagenesis) Stratagene gen, či sekvenci kterou budeme chtít mutovat, je třeba naklonovat do vhodného vektoru navržení dvou komplementárních primerů, v místě kde chceme mutovat, nesoucí tuto mutaci M G A L L W L původní sekvence 5’ ATG GGA GCT CTA TTA ACC TTA 3’ forward primer 3’ TAC CCT CGA GAT AAT TCG AAT 5’ reverse primer 5’ ATG GGA GCT CTA TTA AGC TTA 3’ M G A L L S L PCR s těmito primery na templátový plasmid a s Pfu polymerasou vytváří se nové cirkulární DNA nesoucí mutaci, jsou k sobě komplementární a drží u sebe, mají přerušení v místě konce primerů (tzv. nick) ošetření restrikční endonukleasou DpnI (štěpí pouze methylovanou DNA, templátový plasmid) transformace do bakterie a namnožení mutovaného plasmidu

TRANSFORMACE baktérii a kvasinek přímý genetický přenos informace (DNA) z okolí do organismu buňka schopná přijmout DNA (plasmid) se nazývá KOMPETENTNÍ přirozeně kompetentní jsou některé kmeny Bacillus subtilis, Hemorheae influenze atd. všechny ostatní se mohou transformovat po uvedení do kompetentního stavu dvěma způsoby: A) ELEKTROPORACE B) CHEMICKÁ METODA buňky se pořádně promyjí diH2O smíchají s plasmidovou DNA rozpuštěnou také v diH2O a vloží do elektroporátoru buňky se ošetří roztokem rubidné a vápenaté soli, které způsobují větší permeabilitu membrány DNA se smísí s těmito buňkami a provede se tzv. HEAT SHOCK (45 sec. 42°C)  EFEKTIVITA   NÁROČNOST 

využití mutageneze při studiu regulačních sekvencí genů vytvoření konstruktu studovaného promotoru a reportérového genu promotor reportérový gen vytvoření mutantů pro skenování promotorové aktivity DNA transformace každého konstruktu do buněk lýze buněk a měření aktivity reportérového genu

využití mutageneze při studiu regulačních sekvencí genů konstrukt aktivita reportérového genu reportérové geny: ß-galaktosidasa (kolorimetricky) CAT (chloramfenicolacetyl transferasa) (kolorimetricky) luciferasa (luminiscenčně)

C) mutace kazetová

C) mutace kazetová

C) mutace kazetová dvojitá

D) mutace supresorovou tRNA mutace se ztrátou smyslu (mutace na stop kodon) muže být potlačená tzv. supresorovou tRNA existují mutantní tRNA geny (mutace v antikodonu), které rozpoznávají tyto kodony jako funkční a začleňují do vznikajícího polypetidu místo ukončení další AK tzv. supresorové tRNA. ty mohou být pro libovolnou AK, používají se např. pro vnášení speciálních AK do proteinu (nutno vnést i nový gen pro aminoacyl tRNA syntasu)

- příprava knockoutovaných linií organismů CÍLENÁ MANIPULACE GENOMU - příprava knockoutovaných linií organismů HR – homologní rekombinace NHEJ – nehomologní lepení konců

ZINC FINGER NUCLEASES chimerické proteiny vytvořené spojením Fok I nukleasy a specifických sekvencí zvaných „zinkové prsty“

ZINC FINGER NUCLEASES

Testování specifity ZFN

Knock-out genu pomocí ZFN Shukla et al (2009): Precise genome modification in the crop species using ZFN. Nature 459

SEKVENCOVÁNÍ GENOMŮ

sekvencování jednotlivých klonů (srovnávací a integrační) SEKVENCOVÁNÍ GENOMU příprava knihovny sekvencování jednotlivých klonů sestavení genomu vyplnění mezer předpovězení genů anotace genů analýza genomu (srovnávací a integrační)

SEKVENCOVÁNÍ GENOMU genetická mapa 5.264 mikrosatelitů mapování genomu (chromozomu): genomové mapování bylo umožněno objevem specifických abundantních genetických markeru (mikrosatelitů) do 1994, bylo na lidské genomové mapě lokalizováno: 5.264 mikrosatelitů na 2.335 chromozomových lokusech (průměrná vzdálenost mezi markery je 599 kb) bylo také odsekvenováno tisíce STS sequence tagged site (STS) genetická mapa 5.264 mikrosatelitů

SEKVENCOVÁNÍ GENOMU Dva typy přístupů pro sekvencování genomů: 1. Metoda PROCHÁZENÍ CHROMOZOMU (Chromosome walking) vychází z mapy genomu, začíná se od markeru a sekvencuje se klon za klonem levné, ale zdlouhavé pro sestrojení knihovny se používají BAC vektory (kapacita 300kb)

SEKVENCOVÁNÍ GENOMU 2. Metoda SHOTGUN SEKVENCOVÁNÍ vytvoření BAC klonů pro každý chromozom (jeden lidský chromozom se vejde asi do tři stovek BAC klonů). rozrušení inzertů (Sau3AI, nebo kombinace RE), separace na gelu podle délek a překlonování ±2kbp fragmentů do normálních plasmidových vektorů koncové sekvencování pomocí univerzálních vektorových primerů sekvenace všech inzertů (jedna sekvenační reakce umožní přečtení max. 700 bází) počítačové poskládáni překrývajících se úseků (kontigů) do větších celků a vytvoření superkontigů (superrychlé počítače) drahá, ale rychlá metoda (většina velkých genomů byla odsekvencována takto)

SEKVENCOVÁNÍ GENOMU genom náhodné štípání plazmidy (2 – 10 Kbp) kosmidy (40 Kbp) BAC (300Kbp) ~500 bp ~500 bp ~500 bp ~500 bp koncové sekvenování (500-700 bp)

SEKVENCOVÁNÍ GENOMU

U VELKÝCH EUKARYOTICKÝCH GENOMŮ JE S 2 kb KLONOVANÝMI ÚSEKY PROBLÉM SEKVENCOVÁNÍ GENOMU U VELKÝCH EUKARYOTICKÝCH GENOMŮ JE S 2 kb KLONOVANÝMI ÚSEKY PROBLÉM velikost repetitivních sekvencí může být až 5 kb mnoho 2 kb klonů proto obsahovalo dlouhé repetitivní sekvence výsledkem bylo zastavení sestavování genomu a přerušení sekvence dané úseky se musely naklonovat znova ve větších fragmentech tak aby bylo možno sestavit kontigy (10kb)

REPETITIVNÍ SEKVENCE EUKARYOTICKÉHO GENOMU

REPETITIVNÍ SEKVENCE EUKARYOTICKÉHO GENOMU Nekódující DNA (90-95%) nachází se mezi geny (extragenová) nebo v genech (intragenová) Single Copy DNA jedinečná Repetitivní DNA 30 % celkové jaderné DNA repetitivní geny (histony, rRNA, tRNA) >105 kopií 101-105 kopií Mírně repetitivní Vysoce repetitivní (tandemová) SINEs Short interspersed elements. např. lidské ALU segmenty LINEs Long interspersed elements. např. lidské Kpn segmenty Minisatelity 15bp repetice náhodně roztroušené Satelitní DNA dlouhé repetice kolem centromer a telomer Mikrosatelity 2-6 bp repetice náhodně roztroušené a variabilní v počtu opakování v rámci populace VNTRs Variable number Tandem Repeats GC-rich 300 bp 105-106 bp AT-rich 1.5-6 kb 104-106 bp

PARAZITICKÁ DNA

PROJEKT SEKVENACE LIDSKÉHO GENOMU Dva hlavní projekty: Human Genome Project (HGP) mezinárodní konsorcium placeno z veřejných peněz Francis Collins, National Human Genome Res. Inst. (NHGRI) začalo fungovat 1990 v USA sekvenování pomocí genomových map Celera Genomics Corporation (CRA) soukromá firma J. Craig Venter, založeno 1998 shotgun sekvencování Obě skupiny vycházely ze vzorku DNA izolované z krve a spermatu anonymních dárců mužského i ženského pohlaví různých etnik

PROJEKT SEKVENACE LIDSKÉHO GENOMU 16 únor 2001: první kompaktní výsledky publikováné současně v Nature & Science. HGP: ~22.1 miliard odsekvenovaných nukleotidů 7x překryv CELERA: ~14.5 miliard odsekvenovaných nukleotidů 4.6x překryv 26.4 millionů 550 bp sekvenačních reakcí POKRYTO >99% genomu 20,000 CPU hodin (833 CPU dnů) na superpočítači

PROJEKT SEKVENACE LIDSKÉHO GENOMU Identifikace genů v DNA sekvenci: ANOTACE GENU – identifikace a popis pravděpodobného genu a předpovězeni jeho funkce počítačový algoritmus pro všechny ORF open reading frame ORF – potenciální kódující sekvence pro protein začínající start kodónem a končící stop kodónem ne všechny ORFs kódují proteiny (6-7% nekódují u kvasinek) minimální délka ORF (100bp) velmi složitý algoritmus pro ORF s introny (eukaryota) hledání homologie v databázích – předpovědění funkce a evolučních vztahu

Solitární gen: • v celém genomu v jediné kopii (asi polovina genů) Genová rodina: • skupina genů evolučně pocházející z jediného genu, v evoluci postupná diverzifikace sekvence a funkce Pseudogen: • gen který zmutoval natolik že nemůže být přepisován (v celém genomu > 20 000) Zpracovaný (“processed”) pseudogen: • pseudogen vzniklý zpětným přepisem mRNA a integrací do genomu

PROJEKT SEKVENACE LIDSKÉHO GENOMU CELKOVÁ VELIKOST ±3.200.000.000 bp (haploidní stav) méně genů než se očekávalo: 30-40,000 (2001) předpovídalo se 150,000 (před sekvenací) poslední odhady 20.500 (2007) méně než Arabidopsis (25.478), červi (19.500) mezidruhové odlišnosti druhu Homo sapiens v rámci celého genomu kolem 0.1% (většina je v nekódujících sekvencích) 99% homologie s ostatními primáty (v genech), 96% (celkem) 1.5% z celkové sekvence genomu kóduje proteiny, 28% je však transkribováno do mRNA geny se nacházejí obecně v GC-bohatých regionech parazitická DNA tvoří 45% genomu. Tyto transpozomální elementy však už většinou nejsou aktivní (stále jsou ale aktivní u myši) 223 genů je z bakterií získaných paraziticky (nebyly nalezeny v kvasinkách ani octomilce)

pomáhá rozpoznat důležité regulační regiony. KOMPARATIVNÍ GENOMIKA: sleduje konzervativní sekvence mezi různými organismy pomáhá rozpoznat důležité regulační regiony. myš a člověk mají téměř totožné geny rozdíly pravděpodobně v jejích regulaci a síle exprese homologní úseky jsou na různých chromozomech uplatňuje se ve velké míře alternativní sestřih (jedná mRNA produkuje různé proteiny) ostrovy genetické stability

ZAJÍMAVOSTI Chromozom 1 nese nejvíc genů (2968), a nejméně mužský Y chromozom 231 (78 krátké raménko). bylo objeveno kolem 3 miliónu míst kde dochází k mutacím (SNP – single nucleotide polymorfism) – příslib pro léčbu geneticky podmíněných chorob největší rozdíly jsou v genech spojených se sluchem a čichem v oblasti genomu kde jsou obsaženy geny spojeny s čichem, bylo nalezeno nejvíce mutací 50 genů šimpanzům chybí

OSTATNÍ ODSEKVENOVANÉ GENOMY

OSTATNÍ ODSEKVENOVANÉ GENOMY první odsekvenovaný genom žijícího organismu Haemophilus influenzae 1995 baktérie způsobující zánět mozkových blan u dětí rok 2001 1981 2002 2003 2009 ??? 1998 2000 1996 organismus Velikost (Mbp) počet genů člověk (Homo sapiens) lidská mitochondriální DNA 3.200 0.016 20-25.000 32 laboratorní myš (M. musculus) 2.600 ± 25.000 rýže (Oryza sativa) huseníček (A. thaliana) kukuřice (Zea mays) pšenice (Triticum aestivum) 430 125 2.500 15.000 ± 60.000 25.498 ± 40-60.000 hlíst (C. elegans) 97 ± 19.000 octomilka (D. melanogaster) 137 13.472 kvasinka (S. cerevisiae) 12.1 5.770 bakterie (E. coli) 4.6 4.377 virus (HIV) 0.009 9 kvasinka člověk

organismus s největším známým genomem: Psilotum nudum 250.000 Mbp další: česnek, ropucha, borovice, bahník PRUTOVKA HOLÁ (Psilotum nudum) rostlina, která "zapomněla" vymřít Existují pouze dva druhy prutovek. Mají pro botaniku zvláštní význam z hlediska evoluce rostlin. Velmi se podobají zcela vymřelým psilofytům, výtrusným rostlinám známým jen ze silurských až devonských zkamenělin, starých přes 300 milionů let. Psilofyty stály na samém počátku vývoje všech vyšších neboli cévnatých rostlin, jež potom úplně okupovaly zprvu pusté pevniny naší planety. Roste na Havaji.

VÝZNAM SEKVENACE GENOMU počet genů, přesná poloha a funkce regulace genů struktura chromozomů a jeho organizace funkce nekodující sekvence, typy, množství a distribuce koordinace genové exprese a postranslační úpravy PROTEOMIKA interakce protein – protein předpovězená vs. experimentálně ověřená funkce evolučně konzervativní vztahy mezi organismy MEDICÍNA korelace (SingleNucleotidePolymorfism) s nemocemi předpovídání náchylnosti k nemocem na základě sekvenční variability (identifikace regionů DNA spojených s multigenovými nemocemi) navrhování léčiv na základě molekulární informace navrhování léčiv na míru na základě individuální genetického profilu (farmakogenomika)

mezinárodní program mapující lidskou druhovou variabilitu HapMap mezinárodní program mapující lidskou druhovou variabilitu • konsorcium vědců ze 6 států od roku 2002 – se sestavují mapy vzorců SNP vyskytující v rámci populací jednotlivých ras v Africe, Asii a Spojených státech • cílem je dramaticky snížit celkový počet nalezených SNP (3.000.000) selektování těch, které souvisejí s geneticky podmíněnými nemocemi

Pyrosekvencování DNA polymerasa dNTP mix ATP sulfurylasa Adenosine 5 fosfosulfát Luciferasa Luciferin Apyrasa http://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGFe0aA

Izolace genomové DNA a restrikce na vhodné fragmenty (300-800 bp) Zatupení konců a navázání adaptorové sekvence s biotinovou značkou (modrá) a druhé bez (červená) Navázání na kuličky se streptavidinem Nanesení na mikroreaktorovou destičku Provedení emulsního PCR (červený a modrý primer) Paralelní pyrosekvencování ve všech jamkách

Roche 454/GS FLX Sequencing Technology

Illumina/Solexa metoda cyklické reverzibilní terminace 1. 3. 2. 6. 4. 5.

„Bridge“ PCR

cyklická reverzibilní terminace Chemické štěpení ve vodném prostředí za katalýzy paladiem DEALLYLACE

Illumina/Solexa - vyhodnocení

Cena přečtení lidského genomu SROVNÁNÍ platforma Příprava templátu chemismus Délka jednoho čtení (bp) Doba běhu Přečtené Gb na jeden běh Cena přístroje (USD) Cena přečtení lidského genomu ROCHE 454 Fragmentace + emulsní PCR pyrosekvencování 330 8 hod. 0.45 500.000 1.000.000 ILLUMINA SOLEXA Fragmentace + „bridge“ PCR Cyklická reverzibilní terminace 35 9 dní 540.000 200.000 ROCHE 454 + dlouhé běhy, lze dělat i de novo nekomplikované genomy (mikroorganismy) + rychlé -- chyby v homopolymerních repeticích (AAAAAAAAA, GGGGGGGGGGG) ILLUMINA/ + nejpoužívanější SOLEXA + obrovský rozsah, resekvenace celého genomu v jednom běhu -- nízká multiplexita

Metagenomika Metagenom Genom X Pyrosekvencování a technologie Roche 454 umožnili rozvoj metagenomiky: Rychlé a levné sekvencování genomů jednotlivců Nelze sekvencovat neznáme genomy, kvůli obtížnosti přiřazení (repetice) pouze ty u kterých je znám homologický genom (stejného biologického druhu) Metagenomika studium biologické rozmanitosti a genetického materiálu celé komunity (mikro)organismů přímo v jejich přirozeném prostředí bez nutnosti jejich kultivace v laboratoři (např. z půdy, střevní mikroflora) Metagenom Genom X celková genetická informace komunity organismů celková genetická informace jednoho organismu

Střevní mikroflóra P. J. Turnbaugh et al. (2006) An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. Dec 21;444(7122):1027-31. Apendikální mikrobiální DNA z ob/ob, ob/+, +/+ myši Složení mikroflóry střeva závislé na obezitě změny v zastoupení bakteriálních kmenů Bacteroidetes a Firmicutes změny v metabolickém potenciálu střeva (ukládání energie)

DNA mamuta - Mammoth Project Hendrik N. Poinar et al (2006): Metagenomics to Paleogenomics: Large-Scale Sequencing of Mammoth DNA. Science Jan. 20, 311 (5759): 392-394. DNA extrahována z 1 g mamutí kosti (28000 let, Siberia) – 100 ml DNA fragmenty 500 – 700 bp „454“ sekvenování 28 miliónů bp 302 692 čtení 45,4% čtení se přirovnalo se sekvencí slona afrického, 1,4% - s lidskou a 1,2% se psí sekvencí.

největší význam DIAGNOSTIKA zlevnit přesekvencování lidského genomu na 1.000 USD (do roku 2015) (nové levnější přístupy: SOLID Applied Biosystems, HELIOS) CANCER GENOME ATLAS TRANSCRIPTOME SEQUENCING (RNA-seq) – výhoda oproti DNA čipům je že 100% postihuje alternativní sestřih a alelickou variabilitu SINGLE MOLECULE SEQUENCING (Helios) – preinplantační diagnostika SOLID PHASE CAPTURE – NimbleGene™ čip vyrobený pro vychytání kodujících sekvencí a regulačních oblastí z rozfragmentované genomické DNA před vlastním vysokoúčinným sekvencováním

největší význam DIAGNOSTIKA zlevnit přesekvencování lidského genomu na 1.000 USD (do roku 2015) (nové levnější přístupy: SOLID Applied Biosystem, HELIOS) CANCER GENOME ATLAS TRANSCRIPTOME SEQUENCING (RNA-seq) – výhoda oproti DNA čipům je že 100% postihuje alternativní sestřih a alelickou variabilitu SINGLE MOLECULE SEQUENCING (Helios) – preinplantační diagnostika SOLID PHASE CAPTURE – NimbleGene™ čip vyrobený pro vychytání kodujících sekvencí a regulačních oblastí z rozfragmentované genomické DNA před vlastním vysokoúčinným sekvencováním

DIAGNOSTIKA ChIP-seq (chromatin imuno precipitation) Methyl-seq detekce CpG oblastí (epigenetika) využívá konverze cytidinu na uridin za pomocí bisulfidu methylovaný cytidin není konvertován

cDNA a GENOMOVÉ KNIHOVNY je to soubor náhodně klonovaných fragmentů genomové DNA nebo cDNA, připravené zpětnou transkripci mRNA, příslušného organismu do vhodného vektoru, ve kterém může být tento soubor DNA klonů uchováván a množen

cDNA a GENOMOVÉ KNIHOVNY slouží především ke hledání nových genů a jejích klonování pro další funkční analýzu knihovny lze sestrojit pro všechny živé organismy, pro vědecky významné existuji komerčně dostupné knihovny genomová knihovna obsahuje veškerou informaci obsaženou v genomu (geny a nekódující sekvence) cDNA knihovna obsahuje pouze geny exprimované v určitém stádiu vývoje organismu popř. ve specifické tkáni či pletivu jako klonovací vektory pro konstrukci knihoven se používají především vektory odvozené od bakteriofága λ, fazmidy, kosmidy nebo YAC a BAC

genomové knihovny lambda FIX® II (Stratagene) XhoI → Sau3A I → 4-místné GATC částečné štěpení RE zaručuje překryvy (kontigy) substituční vektor Spi+ selekce klonované fragmenty 9-23kb

genomové knihovny lambda FIX® II Avian Baboon Bacterial Bovine Canine Cephalopod Chicken Drosophila Feline Fungus Gorilla Guinea Pig Hamster Horse Human Lobster Marsupial Monkey Mouse Nematode Plant Porcine Rabbit Rat Salamander Xenopus Yeast Zebrafish Product: Horse Genomic, Leukocytes Library Arabian, adult stallion, heterozygous for immunodeficiency, Vector: Lambda FIX® II vector, Insert Size: 9 - 23 kb Arabidopsis thaliana Nicotiana Plumbaginifolia barley corn pea soybean Xenopus (drápatka)  zebrafish (první transgenní ryba)

cDNA knihovny lambda ZAP® II inzerční vektor fazmid blue/white screening klonované fragmenty 0-10kb

cDNA knihovny lambda ZAP® II Výhody: vysoká efektivnost fágové infekce plazmid (pBlueskript) se vyštěpuje z fazmidu (s plazmidem se lépe manipuluje a sekvencuje) zvýšené zastoupení málo abundantních transkriptů: pomocí metody SSH (supressive and subtractive hybridization) se sníží množství vysoce abundantních transkriptů (např. transkripty Rubisco tvoří často 10% z celkové rostlinné cDNA) pomocný fág (má mutaci tak, že se sám nereplikuje ale po koinfekci s fazmidem mu umožní vytvořit infekční částice, tím že vytvoří sbalovací proteiny, jejichž genetická informace na klonovaném fazmidu chybí. Navíc nese aparát pro tvorbu ssDNA.

supressive and subtractive hybridization (SSH) studovaná RNA srovnávací RNA studovaná RNA raritní molekuly zůstávají více nehybridizované hybridizace – kinetika druhého řádu, abundantní molekuly hybridizují velice rychle spolu další využití: zjišťování nebezpečných genů u patogenních organismů

EST klony (Expressed Sequence Tags) Co to je EST? krátká DNA sekvence (okolo 300 - 1000 bp) odvozená z cDNA reprezentuje geny exprimované ve tkáních ze kterých je odvozena cDNA knihovna - TRANSCRIPTOM pletivově specifické cDNA knihovny listy, kořeny, semena, plody, pyl, květy….. specifické cDNA knihovny po infekci patogenem, po působení hormonů, stresu atd. Výhody EST sekvenci zdroj informaci o genech exprimovaných ve specifických tkáních, nebo v závislosti na odpovědi vůči vnějším vlivům základní srovnávání mezi různými organismy základ pro rozlišování genových rodin a identifikace alelických variací popř. alternativniho sestřihu Nedostatky EST klonů cDNA neobsahuje regulační oblasti a celé kompaktní geny často jenom 3 a 5 konce cDNA klonů (500-700 bp, jedna sekvenační reakce) syrová data, chyby

hledání genů in silico v internetových databazích TIGR a GeneBank

hledání genů in silico v internetových databazích TIGR a GeneBank Výsledky hledání v GenBank....

počty EST klonů v databázích k roku 2003 výsledek hledání pro polygalakturonasu z rajčete  počty EST klonů v databázích k roku 2003 Člověk – přes pět miliónů EST klonů

cDNA knihovny lambda ZAP® II Algae Baboon Bovine Canine Chicken Feline Fish Fungus Hamster Human Fetal Human Human Neuron and Teratocarcinoma Insect Lobster Marsupial Monkey Mouse Nematode Plant Porcine Rabbit Rat Salamander Sheep Xenopus Human cDNA, Aortic Smooth Muscle Cell Library Human cDNA, Brain (Cerebellum) Library Human cDNA, Brain (Frontal cortex) Library Human cDNA, Breast Carcinoma Library Human cDNA, Erythroleukemia cell Library Human cDNA, Heart Library Human cDNA, Kidney Library Human cDNA, Uterus Library (8 pooled normal whole specimens, Caucasian, 21-60 years, Vector: Uni-ZAP® XR vector, Primer: UdT, Average Insert Size: 1.3 kb) atd. celkem 57 Plant cDNA, Arabidopsis thaliana Library Plant cDNA, Barley Library Plant cDNA, Soybean Library Plant cDNA, Tobacco Leaf Library Plant cDNA, Tomato Library Plant cDNA, Spinach Library (var. Melody, actively growing leaves, Primer: OR, Vector: Lambda ZAP® II vector, Average Insert Size: 1.0 kb)

otisk plaků na nitrocelulosovou membránu SCREENING cDNA denaturace DNA na filtru inkubace s hybridizační sondou vyvolání otisku detekce plaku obsahují požadovaný gen vyříznutí a namnožení požadovaného klonu SCREENING cDNA a GENOMOVÝCH KNIHOVEN

SCREENING BACových knihoven pomocí „poolování“

cDNA a GENOMOVÉ KNIHOVNY VELIKOST KNIHOVNY vyjadřuje kolik rekombinatních fágu (plaků) musíme screenovat abychom prošli celý genom nebo cDNA pool. P……….pravděpodobnost, že je klon zastoupen n……….poměr průměrné velikosti klonovaného inzertu k velikosti genomu např. při screeningu lidského genomu o velikosti 3.200 Mbp který je v λ genomové knihovně s velikosti fragmentů 20 kbp musíme na Petriho miskách vypěstovat pro následnou analýzu alespoň 6.5 x 105 plaků abychom s 99% pravděpodobnosti zaručili, že je analyzován celý genom

cDNA a GENOMOVÉ KNIHOVNY DALŠÍ TYPY KNIHOVEN: EXPRESNÍ GENOMOVÁ KNIHOVNA vychází z cDNA knihovny, která je ale umístěna v expresních vektorech (klonovací vektory, které navíc transgen v nich obsažený exprimují do proteinu) Používají se pro hledaní genů pokud známe pouze protein, který kódují (pomocí protilátky) CHROMOZOMOVÉ KNIHOVNY obsahují informaci pouze z jednoho chromozomu (jsou menší) HYBRIDNÍ KNIHOVNY systém pro studium interakce protein - protein, bait vektor (návnada) obsahuje gen pro protein, který studujeme a fish (prey) vektor (obsahuje danou cDNA expresní knihovnu) s pomocí genomových knihoven se uskutečnila sekvenace celých genomů několika organizmů. díky tomu ale genomové knihovny v současné době ztrácejí na významu (veškerá genetická informace je obsažena in silico a pomocí vhodných primerů si lze kdykoli daný úsek naamplifikovat

YEAST TWO HYBRID SYSTÉM PRO STUDIUM PROTEIN-PROTEIN INTERAKCÍ – význam pro studium regulačních a signálních drah naklonovaná cDNA knihovna z libovolného euk.organismu konstitutivní promotor kvasinkový chromozom