EM eletron microscopy (elektronová mikroskopie) Podívejme se spolu na svět, který není pro běžného smrtelníka dostupný. Některé obrázky a texty byly použity z volně dostupných „www“ zdrojů.

Elektronová mikroskopie jako nástroj diagnostiky Elektronový mikroskop je často uváděn, jako příklad typického vynálezu 20. století. K jeho sestrojení nestačila jedna geniální myšlenka, ale cesta k němu vedla přes postupné skládání objevů mnoha badatelů ve spojení s technologickým pokrokem. Jedním ze základních kamenů této mozaiky byl objev elektronu, který popsal J.J. Thompson v roce 1897. Objevení elektronu bylo v přímé souvislosti se studiem elektrických výbojů v Geisslerově trubici, známé už v polovině 19. století. Dalším krokem vedoucím k použití elektronů k zobrazení mikrosvěta byl poznatek, který v roce 1925 publikoval Luis de Broglie, že rychle letící částice mají nejen korpuskulární, ale i vlnový charakter jako např. viditelné světlo. Toto potvrdili nezávisle na sobě v roce 1927 Davisson s Germerem a Thompson s Reidem elektronovou difrakcí, která jasně demonstrovala vlnovou povahu elektronů. Důležitou roli na cestě k elektronovému mikroskopu sehrály práce H. Buscha, uveřejněné v roce 1926, které se zabývaly analogií ve vychylování paprsku elektronů pomocí magnetických polí solenoidů a světla skleněnou čočkou. Konkrétní představa o možnosti zkonstruovat transmisní elektronový mikroskop vznikla pravděpodobně o dva roky později na Vysoké škole technické v Berlíně

Transmisní elektronový mikroskop Transmisní elektronový mikroskop je možné popsat jako složité technické zařízení, které umožňuje pozorování preparátů do tloušťky 100 nm při vysokém zvětšení a s velkou rozlišovací schopností. Vzhledem k příbuznosti paprskových diagramů lze jej považovat za analogii světelného mikroskopu v procházejícím světle. Oba přístroje mají společnou i řadu součástí - zdroje světla nebo elektronů, čočky skleněné nebo elektromagnetické a v obou se preparát umísťuje na mechanický stolek. TEM potřebuje ke své činnosti i mnoho dalších systémů, které u světelného mikroskopu nejsou, např. vysokonapěťové zdroje, elektroniku k řízení mikroskopu a výkonný vakuový systém pro vyčerpání jeho vnitřních prostor mikroskopu na hodnotu, která zabezpečí střední volnou dráhu elektronu alespoň v délce 3 m. Jak vlastně TEM pracuje a co zabezpečují jeho jednotlivé části? Na tyto otázky se pokusí odpovědět následující podkapitoly.

Příprava preparátů pro TEM chemickou cestou in situ preparáty

B/ Metoda nepřímá, kdy v mikroskopu pozorujeme Vzorky pro transmisní elektronovou mikroskopii nesmí obsahovat vodu, protože v mikroskopu jsou vystaveny vysokému vakuu a z mokrých preparátů by se voda bouřlivě uvolňovala. To by vedlo jednak jejich degradaci a za druhé i ztěžovalo práci urychleným elektronům, které by se srážkami s molekulami vody brzdily. Proto je nutné biologický materiál, který obsahuje vysoké procento vody, před pozorováním v mikroskopu upravit tak, aby žádnou vodu neobsahoval. Druhou podmínkou, která vyplývá z nízké penetrační schopnosti elektronů, je, že tloušťka preparátu nesmí překročit 100 nm. Silnějšími preparáty elektrony neprojdou a pokud ano, je obraz zatížený značnou chromatickou vadou a nelze jej zaostřit. Obecně existují dvě cesty, jak připravit vzorky pro TEM A/ Přímá metoda, kdy do mikroskopu vkládáme celý studovaný objekt zbavený vody. Jedná se buď o rozměrově nepatrné objekty (suspenze virů, bakterií nebo izolovaných buněčných organel), které můžeme v mikroskopu pozorovat celé, nebo z větších vzorků je třeba připravit řezy tloušťky cca do 100 nm, aby jimi mohly projít urychlené primární elektrony. B/ Metoda nepřímá, kdy v mikroskopu pozorujeme repliku studovaného objektu, ne samotný objekt.

Příprava ultratenkých řezů pro EM http://www.youtube.com/watch?v=NJcLhM3sfEM http://www.youtube.com/watch?v=Lj8uQXQaY-c http://www.youtube.com/watch?v=O0D2fW1a39Y

                                                 0.4 x 2 1 x 2 http://www.youtube.com/watch?v=F0ZNUykXovk http://www.youtube.com/watch?v=doow3RY0bYY

TuMV ToMV BNYVV

P4

Skanovací elektronový mikroskop Skanovací elektronový mikroskop (dále SEM) je přístroj určený k pozorování povrchů nejrůznějších objektů. Je ho možné do jisté míry považovat za analogii světelného mikroskopu v dopadajícím světle, na rozdíl od něho je výsledný obraz tvořen pomocí sekundárního signálu - odražených nebo sekundárních elektronů. Díky tomu je zobrazení v SEM považováno za nepřímou metodu. Velkou předností SEM v porovnání se světelným mikroskopem je jeho velká hloubka ostrosti, v důsledku které lze z dvojrozměrných fotografiích ze SEM nalézt jistý trojrozměrný aspekt. Další předností těchto mikroskopů je, že v komoře preparátů vzniká při interakci urychlených elektronů s hmotou vzorku kromě výše zmíněných signálů ještě řada dalších, např. rtg. záření, Augerovy elektrony, katodoluminiscence, které nesou mnoho dalších informací o vzorku. Při jejich detekci je možné určit např. prvkové složení preparátu v dané oblasti a při porovnání s vhodným standardem určit i kvantitativní zastoupení jednotlivých prvků. V literatuře se kromě názvu skanovací používá i označení rastrovací nebo český název řádkovací elektronový mikroskop, který naznačuje, že při práci mikroskopu se primární svazek pohybuje po určité ploše preparátu.

Příprava preparátů pro SEM Stejně jako v případě TEM ani v SEM většinou nelze biologické materiály prohlížet bez jejich úpravy. Preparát vhodný pro prohlížení v mikroskopu musí totiž splňovat následující kritéria: - na jeho povrchu by se neměly vyskytovat cizorodé částice, např. prach - měl by být stabilní ve vakuu - stabilitu by měl vykazovat i při ozáření elektronovým paprskem - měl by produkovat dostatečné množství požadovaného signálu, např. sekundárních elektronů - při expozici primárním elektronům by nemělo docházet k jeho nabíjení Některé biologické objekty tyto předpoklady bez problémů splňují, jako např. různé mineralizované struktury, zuby, kosti, schránky rozsivek, ale i rostlinný materiál typu dřevo, pylová zrna apod. Ve většině případů však biologické vzorky obsahují vodu, která z nich musí být před prohlížením odstraněna, což znamená jejich úpravu. Výběr metody závisí na typu preparátu a informacích, které o něm chceme získat. Živočišné tkáně a orgány, rostlinné tkáně představují preparáty, které jsou dosti choulostivé a vyžadují jemné zacházení. Jejich příprava začíná kvalitní fixací. Problematické bývá příprava mikroorganismů, jako jsou např. bakterie, prvoci, plankton, především z hlediska manipulace s preparátem. Po každém kroku musí být tyto vzorky centrifugovány, což je nebezpečný zdroj tvarových změn. Východiskem může být jejich přilepení na vhodnou podložku, např. krycí sklíčko, nebo zachycení na filtr, se kterým se pak dále pracuje.

Pokovování preparátu se provádí několika způsoby: Vysušené biologické objekty jsou téměř elektricky a tepelně nevodivé. Při jejich prohlížení v SEM dochází k nabíjení rastrovaného povrchu primárními elektrony, které se projevuje deformacemi a ztrátou ostrosti obrazu. K eliminaci nabíjecích jevů se proto preparát pokrývá vrstvičkou kovu o tloušťce cca 10-20 nm, která má za úkol odvést negativní náboj, zvýšit produkci sekundárních elektronů a minimalizovat poškození preparátu teplem uvolněným brzdícími se primárními elektrony. Nejčastěji se používá zlato, platina nebo slitina platiny a paládia. Výběr kovu se odvíjí od požadované granularity vrstvy kovu, obecně platí, že čím vyšší je bod tání napařovaného kovu, tím menší je granularita vrstvy Pokovování preparátu se provádí několika způsoby: 1/ vakuovým napařováním - daný kov se v napařovací aparatuře za vysokého vakua elektricky zahřeje na teplotu, při které se z jeho povrchu začnou odpařovat jednotlivé molekuly 2/ iontové naprašování - je založeno na vzniku usměrněného výboje v prostředí nízkotlaké argonové atmosféry účinkem elektrického napětí 3/ impregnace - je vytvoření nánosu kovu na povrchu preparátu chemickou cestou a využívá se jí v případech, kdy není k dispozici speciální aparatura anebo je preparát z části vodivý. Nejznámější postupy jsou založeny na reakci osmia a kyseliny tanové, označují se zkratkou TAO, nebo schopnosti thiokarbohydrazidu vázat osmium, zkratka pro tuto metodu je OTO.

Výhody a nevýhody + Konkretizace částic (vidíme to co potřebujeme – patogena?) + Potvrzení (reference) - je to opravdu ten patogen kterého jsme diagnostikovali jinými technikami + nízké náklady na přípravu preparátu - vysoké náklady na přístrojové vybavení Velká časová náročnost personální náročnost nízký počet vzorků pro analýzu

Variace na téma TEM Kolorace virů využití protilátek pro zvýraznění obalu viru ITEM-

Hybridization in situ