Kvantitativní analýza Metoda kalibrační křivky Metoda interního standardu Metoda kalibrační křivky – vyžaduje konstantní nástřik vzorku i standardů. Změří se závislost plochy na koncentraci standardu v koncentračním rozmezí, které je očekáváno ve vzorku. Sestrojí se kalibrační graf a z něho po změření plochy stanovovaného analytu odečteme koncentraci. Metoda interního standardu – používá se interní standard (IS) IS = látka, která se určitě ve stanovaném vzorku nevyskytuje a zároveň migruje blízko zóny analytu. IS se přídá jak do kalibračních roztoků tak do vzorku tak, aby jeho koncentrace byla všude stejná. Do kalibrační závislosti se pak vznáší poměr plochy analytu a IS. Metoda IS je přesnější, protože eliminuje chyby při nástřiku

Pro kvantitativní analýzu se nástřik provádí téměř výhradně hydrodynamicky. Elektrokinetický nástřik diskriminuje analyty ve vzorku podle jejich klesající mobility, tj. ionty s vyšší pohyblivostí se nadávkují ve vyšším množství oproti iontům méně pohyblivějším. Charakteristiky účinnosti Vycházejí z kolonové chromatografie a z teorie tzv. teoretického patra. Ideální = Gaussovský pík Reálný pík se gaussovskému pouze blíží!

Šířka píku při základně Účinnost vyjádřená jako počet TP Vztah pro výpočet N z elektroforegramu

Pro CE techniky lze předpokládat, že k rozmytí píků (a tím ke ztrátě účinnosti a separace) dochází pouze díky podélné difúzi. Pak platí: D…difúzní koeficient analytu. Toto je ovšem značně idealizovaný popis, který neplatí na reálné systémy = N bude vždy menší než udává tento vztah. Příspěvky všech faktorů ovlivňující rozmytí píků (injekce, teplota, adsorpce, detekce, elektrodisperze)

Micelární elektrokinetická chromatografie – MEKC Elektromigrační technika umožňující separaci neutrálních (hydrofóbních, nepolárních) látek v elektrickém poli. MEKC může být použitá i pro separaci látek nabitých. Separace probíhá v křemenných kapilárách v pracovním elektrolytu (pufru) s přídavkem tenzidu TENZID – látka, která snižuje a ovlivňuje povrchové napětí, mezipovrchové napětí a smáčivost. Molekula tenzidu se vždy skládá z hydrofóbní části (nepolární) a z hydrofilní částí (polární). Hydrofilní část Hydrofóbní část

Tenzidy umožňují rozpouštění (solubilizaci) nepolární, hydrofóbních látek, které jsou bez přádavku tenzidů špatně rozpustné ve vodě (polárním rozpuštědle), nebo jsou úplně ve vodě nerozpustné. Aniontové Kationtové Tenzidy Neiontové Amfoterní

Nejpoužívanější tenzidy v MEKC SDS je nejvyužívanější tenzid pro separace neionogenních látek pomocí MEKC

CMC – kritická micelární koncentrace Koncentrace tenzidu nad, kterou za daných podmínek (T, typ rozpouštědla, iontové síle…) vytvářejí molekuly (monomery) tenzidů v roztoku tzv. nadmolekulární útvary - MICELY Příklad micely aniontového a kationtového tenzidu Hydrofóbní jádro Hydrofilní „obal“ micely Hydrofóbní jádro interaguje s nepolárními (hydrofóbními) látkami, hydrofilní obal interaguje s polárními látkami nebo s ionty opačného znaménka.

Agregační číslo N Počet monomerů tenzidu tvořící za daných podmínek strukturu tenzidy (typicky pro iontové tenzidy jsou to řádově desítky molekul). SEPARACE POMOCÍ MEKC se odehrává v pracovních elektrolytech o neutrálním až alkalickém pH (nejčastěji 7 až 9) za přítomnosti silného (rychlého) elektroosmotického toku, který napomáhá separaci uskutečnit.

Nenabité látky se elektrickém poli bez přítomnosti tenzidů pohybují stejnou rychlostí jako se pohybuje EOF, ale nedochází k jejich separaci. Použijeme-li nepř. aniontový tenzid (SDS) o koncentraci rovnou jeho CMC nebo vyšší v daném pracovním elektrolytu, můžou nenabité látky interagovat s hydrofóbními jádry micely a budou se tedy pohybovat stejnou rychlostí jako je rychlost pohybu micely a vzájemná separace neutrálních látek je řízena rozdílnými hodnotami tzv. rozdělovacích koeficientů popisující míru interakce mezi micelou a neutrální látkou. V případě použití SDS migrují micely proti směru EOF!

Vztah kapacitního faktoru (má stejný význam jako v kapalinové chromatografii) a rozdělovacího koeficientu.

Příklad separace zneužívaných drog pomocí MEKC 8,5 mM borát, 8,5 mM fosfát, 85 mM SDS, 15% acetonitril, pH 8,5

V takto pokrytých kapilárách není EOF !!! Kapilární gelová elektroforéza (CGE) Elektromigrační technika kombinující výhody separací v křemenných kapilárách a separací v gelových médiích v plošném uspořádání. Vhodná pouze pro separace makromolekul (oligomerů a peptidů, fragmentů nukleových kyselin, polysacharidů apod.) Pracuje se v pokrytých kapilárách (kovalentně se na Si-OH skupiny navážou derivatizací např. trimethylsilylskupiny) -Si-O-Si(CH3)3 V takto pokrytých kapilárách není EOF !!!

Používají se buď chemické gely nebo fyzikální gely Kapiláry pro CGE jsou navíc ještě vyplněny gelem a pracovním elektrolytem, tak aby mohlo docházet k průchodu elektrického proudu. Používají se buď chemické gely nebo fyzikální gely

Chování gelů v závislosti na koncentraci v roztoku

K separaci CGE dochází na základě rozdílné rychlosti pohybu molekul v elektrickém poli a na základě různé schopnosti procházet přes póry v gely – tj. separace především založena na rozdílné velikosti (hydrodynamickém poloměru). Používané gelové média: polyakrylamidový gel, agarosový gel, alkylcelulózové gely (hydroxyethylcelulosa, hydroxymethylcelulosa, hydroxymethylpropylcelulosa) Polyethylenglykoly, polyvinylalkoholy

Nástřik se v případě CGE provádí elektrokineticky, jinak by došlo k vytlačení gelu z kapiláry ven! Nejčastější gely pro CGE a jejich aplikace

Pro detekci se nejčastěji používá fluorescenční detekce, případně UV spektrofotometrická detekce. Separace polydeoxythymidylových kyselin v polyakrylamidovém gelu (PAGE)

Kapilární elektrochromatografie (CEC) Kombinace elektromigračních technik s kapalinovou chromatografií. Pro separaci se uplatňují mechanismy migrace nabitých částic v elektrickém poli a interakce se stacionární fází Uspořádání typické pro CEC – pro separaci se používají křemenné kapiláry, které navíc obsahují stacionární fází podobně jako v kapalinové chromatografii.

Profil průtoku MF přes kapiláru v případě LC CEC nepotřebuje vysokotlakou pumpu pro zajištění pohybu mobilní fáze (MF) přes kapiláru, pumpou je v tomto případě generovaný EOF. Profil průtoku MF přes kapiláru v případě LC Profil průtoku MF přes kapiláru v případě CE

K vytvoření EOF přispívá jak náboj vnitřní stěny kapiláry tak náboj na částicích stacionární fáze. Pro CEC se nejčastěji využívají kapiláry o vnitřním průměru 100 mm, které jsou vyplněny částicemi stacionární fáze o průměr 3 až 5 mm. Nejčastější typ SF je C8 a C18 fáze – tzv. reversní fáze.

Stacionární fáze je v kapiláře umístěna mezi dvě polopropustné frity (zadrženy jsou částice SF nikoliv molekuly MF) Detekční okénko následuje ve „volné části kapiláry“ za fritou tak, aby mohlo docházet k on-column detekci.

EOF v kapilárách s C8 a C18 stacionární fázi v kyselé a bazické oblasti

Jako mobilní fáze se vždy používá vodný pufr s přídavky organických rozpouštědel (methanol, acetonitril, dimetylformamid, dimethylsulfoxid).

Separace aromatických uhlovodíků CEC na C18 stacionární fázi.

Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF) Kapilární elektromigrační technika, která umožňuje separovat amfolyty na základě rozdílných hodnot pI. Nejčastěji používaná pro separaci (ale i stanovení hodnot pI) peptidů a proteinů. Umožňuje provést separaci dvojice amfolytů, lišící se o 0,005 hodnoty pI. Schéma CIEF

Pro úspěšnou CIEF je potřeba vytvořit v kapiláře gradient pH, což se provádí tak, že se kapilára vyplní roztokem směsi amfolytů, které slouží pro vytvoření gradientu pH a vzorku. Anoda spolu s anodickým koncem kapiláry je ponořena do elektrolytu o kyselém pH a katoda do roztoku o basickém pH. Po aplikaci stejnosměrného napětí dojde k vytvoření gradientu pH podél kapiláry: pH se mění spojitě z kyselé oblasti až do bazické směrem od anody ke katodě. Současně nabité amfolyty vzorku migrují směrem k opačně nabité elektrodě a protože procházejí postupně oblastmi s měnícím se pH - mění se i jejich výsledný náboj. V místě kde je pH shodné s pI přestane separovaný amfolyt migrovat, vytvoří velmi úzkou zónu, kde dochází k jeho zakoncentrování. Proces zakoncentrování je označován jako fokusování. Roztok amfolytů je komerčně dostupný a je tvořen směsí sloučenin s rozdílnými hodnotami pI mající bazické amino- a kyselé karboxy- skupiny.

Nejčastěji se pro CIEF používá rozmezí pH 3 – 10 Anolyt – asi 0,02 M kyselina fosforečná Katolyt – asi 0,02 M hydroxid sodný

CIEF se provádí v kapilárách, kde je potlačen EOF (m EOF = 0) Pro potlačení EOF se používá kovalentní pokrytí polyakrylamidem dynamické pokryté methylcelulosou Výhodou CIEF je dávkování vzorku do celého objemu kapiláry, lze tedy nadávkovat větší objem vzorku o nižších koncentracích než v případě jiných elektromigračních technik. Po skončení fokusace je potřeba oddělené zóny fokusovaných amfolytů vytlačit do detektoru – tzv. mobilizace fokusovaných zón Hydrodynamická mobilizace Elektroforetická mobilizace

Hydrodynamická mobilizace Po fokusaci se zóny vytlačí do detektoru pomocí pumpy (nevhodné pro kapiláry, které jsou vyplněné gelem). Elektroforetická mobilizace Po fokusaci se zóny mobilizují porušením vytvořeného gradientu pH. Buď se vymění anolyt za roztok NaOH (katolyt a anolyt budou mít stejné složení) nebo se katolyt vymění za roztok kyseliny fosforečné. Jestliže je anolyt vyměnen ze roztok NaOH, budou OH- ionty migrovat směrem k anodě. Na+ ionty budou migrovat směrem ke katodě, ale nebudou způsobovat změnu pH. Naopak OH- budou postupně titrovat jak separované amfolyty, tak i amfolyty tvořící gradient. Fokusované amfolyty (proteiny) budou mít záporný náboj a migrovat k anodě. Podobná mobilizace se dá provést přídavkem soli do anolytu nebo katolytu.

CIEF směsi proteinů v polyakrylamidové kapiláře

Kapilární izotachoforéza (CITP) Ideální separační a zároveň prekoncentrační kapilární elektromigrační metoda Liší se uspořádáním elektrolytů (pufrů), které jsou používány pro separaci nabitých látek oproti ostatním elektromigračním metodám.

CITP – používají se 2 rozdílné elektrolyty: LEADING electrolyte (vedoucí elektrolyt) TERMINATING electrolyte (koncový elektrolyt) Leading – elektrolyt obsahující iont stejného znaménka jako separované ionty, přičemž má největší mobilitu. Terminating – elektrolyt obsahující iont stejného znaménka jako separované iont, příčemž má nejmenší mobilitu. Separované ionty – benzoát + salicylát Jaké složení musí mít leading a terminating?

Při CITP se pracuje za konstantního proudu, což je rozdílné oproti ostaním elektromigračním technikám. Při CITP analýze se separované molekuly pohybují konstantní rychlostí, tj. mobilita všech separavoných složek je stejná. v = m . E = konst. Jestliže je rychlost pohybu separovaných látek konstantní a mobilita částice je daná elektroforetickou pohyblivostí, pak se během separace mění intenzita elektrického pole v jednotlivých zónách. Intenzita elektrického pole je nejmenší v zóně vedoucího elektrolytu a největší v zóně koncového elektrolytu. Tento jev je příčinou toho, že v CITP migrují zóny analytů ostře ohraničené a nedochází k jejich promíchání difuzí.

Další výhoda CITP – „schopnost koncentračního přizpůsobení zón“ Pracuje-li se za konstatního proudu, pak existuje konstatní poměr mezi koncentrací a mobilitou daného iontu v jeho zóně. Zóny, které jsou koncentrovanější než je koncentrace vedoucího elektrolytu zvětší svůj objem – tj. zředí se do širší zóny. Naopak zóny, které mají nižší koncentraci než vedoucí elektrolyt zmenší svůj objem a zakoncentrují se do užší zóny. Tento důsledek je obsažení v řešení Kohlrauschovi regulační funkce, která má pro uni-univaletní elektolyty tvar:

Vzájemné koncentrační přizpůsobení zón separovaných analytů podle koncentrace vedoucího elektrolytu je velmi výhodné. ITP se tedy používá jako on-line prekoncentrační technika pro zakoncentrování analytů do úzkých zón s následnou separací takto zakoncentrovaných zón analytů pomocí CZE. Toto on-line spojení dvou elektromigračních separačních technik je označováno jako „transient tITP-CZE“ Klasická CZE s UV detektorem dosahuje bez prekoncentrace detekčních limitů řádově okolo jednotek mM, s použtím tITP-CZE se dosahuje detekčního limitu až 1000 x nižšího.

Jako detektory se používají nejčastěji: vodivostní detektory UV-Vis detektory.

Nejvyužívanější mód elektromigračních technik Kapilární zónová elektroforéza Nejvyužívanější mód elektromigračních technik Separace je dosaženo na základě rozdílných pohyblivostí nabitých částic ve stejnosměrném elektrickém poli Separace je ovlivněna mobilitou a směrem EOF a VŠEMI komlexotvornými, interakčními rovnováhami, kterým mohou podléhat separované analyty. Tyto rovnováhy se využívají pro ovlivnění mobilit separovaných iontů za účelem dosažení požadované separace. Obecně stačí, aby rozdíl mezi mobilitami separovaných částic byl větší než 0,05%.

Vliv pH Tvorba komplexů Tvorba iontových asociátů Nejvyužívanější typy rovnováh v CZE Vliv pH Tvorba komplexů Tvorba iontových asociátů Tvorba „host-guest“ komplexů Vliv nevodných rozpouštědel Vliv ionogenních a neionogenních tenzidů Vliv síťujícího prostředí Tyto rovnáváhy lze libovolně kombinovat, takže lze docílit separace i velmi podobných sloučenin jakou jsou např. polohové nebo optické izomery