Bezpečnost práce v mikrobiologické laboratoři Ochrana – plášť, rukavice převlékat, plášť jen v laboratoři! Nejíst, nepít, nekouřit Hlídat zdravotní stav – těhotenství, alergie… Hygiena – MO mohou být patogenní Úrazy ihned hlásit, i malé ústa vykloktat 1% KMnO4 oči vypláchnout vodou a pak borovou vodou nesbírat rozbité sklo rukou

Bezpečnost práce v mikrobiologické laboratoři Čistota a sterilita – pracovní prostory, nástroje… úklid před započetím práce kontaminované předměty otřít 0,1% Ajatinem úklid po skončení práce Odpadní kultury před likvidací usmrtit (autokláv, chemicky…)

Základy mikrobiologické práce Sterilita Kultivační metody Mikroskopování Chemické analýzy Biochemické analýzy Genetické analýzy

Sterilní práce Při mikrobiologické práci je třeba zbavit se všech nežádoucích MO, které by mohly narušit průběh pokusu Sterilovat je třeba vše potřebné: média laboratorní sklo pracovní plochu nástroje vzduch

Metody sterilace Vlhké teplo Suché teplo Chemické látky Filtrace Plamen Záření

Vlhké teplo Velice účinné proti MO Obvykle za zvýšeného tlaku Zařízení = autokláv Teplota, tlak a čas různé 80-120°C, 0,1-0,2MPa, 15-120 minut

Suché teplo Méně účinné než vlhké teplo = je třeba delší čas (2 hodiny a déle) Pro sterilaci objektů, které nesmějí nebo nemohou zvlhnout chemikálie, suché pracovní nástroje…

Chemické látky Rozmanité látky s mikrobicidním účinkem mají různá použití Savo – hrubá sterilace povrchů Ajatin – důkladná sterilace povrchů Ethanol – sterilace pracovních nástrojů a povrchů

Filtrace Pro tekutiny (plyny a kapaliny) citlivé na zvýšenou teplotu Jemný filtr s póry řádově menšími než velikost bakteriálních buněk Pozor na protržení Flowbox (laminární box) = zařízení foukající filtrovaný vzduch do uzavřeného prostoru

foukání sterilního vzduchu

Plamen Velmi účinný Jednoduché použití Použitelný pro věci s vysokou tepelnou odolností kovové nástroje (kličky, pinzety…) Pro sterilaci vzduchu v jeho okolí Pozor na požár!

Záření Různá účinnost podle vlnové délky Může vyvolávat fotochemické reakce UV nerovné povrchy vzduch germicidní lampa = UV 260-270 nm Gama záření vysoce ionizující pro sterilaci půd a speciálních médií

Média Většina mikrobiologických metod vyžaduje kultivaci MO Živná média přirozená (mléko, krev, listí…) syntetická (definované živiny) polosyntetická (některé živiny přesně definované, jiné přirozené) Podle skupenství tekutá pevná (ztužená)

Média Podle bohatosti Podle selektivity bohatá (všechny živiny v nadbytku) limitovaná (některá živina v nedostatku) Podle selektivity obecná (pro kultivaci velké skupiny organismů) selektivní (pro kultivaci jen omezené skupiny MO)

Složení médií Zdroj uhlíku Zdroj dusíku Další minerální látky sacharidy (glukóza), aminokyseliny, peptidy, lipidy, organické látky… Zdroj dusíku organický (aminokyseliny…) anorganický (amoniak, dusičnany…) Další minerální látky fosfor, síra, biogenní kovy (železo, měď, zinek…)

Složení médií Selektivní činidla Speciální látky pro auxotrofy Voda antibiotika Speciální látky pro auxotrofy aminokyseliny, vitamíny… Voda Vhodné pH pufr Vhodná iontová síla Ztužovadlo

Bohatá média Pepton, Trypton = bílkovinný hydrolyzát (zdroj C i N) Kvasničný extrakt (yeast extract) = zdroj minerálů, lipidů, N, C … přírodní živiny maso, krev, listí…

Selektivní média Negativní selekce – přídavek látek, které brzdí růst jiných mikroorganismů antibiotika barviva Pozitivní selekce – živiny využitelné jen menšinou organismů (neobvyklé) zdroj uhlíku (uhlovodíky, polysacharidy, CO2…) zdroj dusíku (dusičnany, plynný dusík…) ostatní

Selektivita médií Negativní selektivita = nežádoucí MO jsou inhibovány vhodným způsobem inhibiční látka (antibiotika, toxiny) osmotická hladina extrémnější podmínky (pH, teplota) …

Selektivita médií Živina Většinový substrát Selektivní substrát C glukóza polysacharidy, uhlovodíky, org. kyseliny… N NH4+, aminokyseliny dusičnany, dusitany, N2… S org. síra, sírany sulfidy, thiosírany, síra, siřičitany…

Ztužování Nejčastěji přídavek 1-2% agaru do tekutého média Agar = polysacharid (polygalaktóza) z mořských řas taje při 96°C tuhne při 40°C většina MO ho neumí využít jako živinu

Ztužená média Misky Zkumavky (šikmý agar)

Sterilace médií Živná média je nutno zbavit všech nežádoucích MO = sterilace autoklávování – mokré teplo pod tlakem obvykle 100-120°C, 0,1-0,2MPa, 15-120 min filtrování – pro média citlivá na teplo přídavek mikrobicidních látek antibiotika, ethanol…

Sterilace pevných médií Agar tuhne při 40°C Sterilace v autoklávu Rozlití do cílových nádob při vhodné teplotě (50-70°C)

Metody kvantifikace MO MO jsou malé, přímé počítání je obtížné Počítání pod mikroskopem na speciálních sklíčkách s počítací komůrkou obvykle po obarvení Spektrofotometricky – rozptyl světla Kultivačně – jen životaschopné Biochemicky podle chemických látek (bílkoviny, DNA, lipidy) metabolickou činností (respirace…)

Bürkerova komůrka Mikroskopické sklíčko s oddělenými komůrkami o přesném objemu Spočítá se průměrný počet buněk ve čtverci a přepočte se na celkovou koncentraci Bakterie je vhodné obarvit

Bürkerova komůrka

Bürkerova komůrka

Spektrofotometrické stanovení Pro suspenze mikroorganismů Část světla se rozptýlí v kyvetě vyšší hustota = větší rozptyl Měření prošlého světla, výpočet absorbance Spektrofotometr Obvyklé vlnové délky 500-700 nm Lineární jen do A=1, pak nutno ředit

Spektrofotometrické stanovení Detektor

Kultivační stanovení Buněčná suspenze se zředí a rozetře na agarové médium Z každé životaschopné buňky vyroste jedna viditelná kolonie Kolonie se sečtou a přepočítají na původní objem Tzv. Colony Forming Units (CFU) Kolonie tvořící jednotky (KTJ) Použitím selektivního média je možné stanovit jen vybrané skupiny MO

Biochemická stanovení Obsah některých látek přibližně koreluje s množstvím MO obsah dusíku obsah bílkovin vybrané lipidy Je vždy nutná kalibrace pro dané stanovení

Izolace MO V prostředí jsou MO přítomné ve společenstvech Izolace je založena na ředění a kultivaci z jednoho MO jedna kolonie !!!!! Předpokládá se, že dnešními metodami je kultivovatelných jen několik procent všech mikrobiálních druhů!!!!

Metody identifikace MO Morfologické tvar těla a orgánů Metabolické produkce či přeměna některých látek Imunologické Biochemické identifikační molekuly (mastné kyseliny, sacharidy…) Genetické sekvence DNA / RNA zastoupení bazí

Morfologické znaky Málo přesné Význam hlavně u eukaryot (plísně, prvoci) tvar mycelia způsob dělení fruktifikační orgány U bakterií málo používané – hodně druhů a málo tvarů tvar buněk (koky, tyčinky…) grampozitivita

Metabolické metody Hlavně u prokaryot (eukaryota mají velmi unifikovaný metabolismus) produkce či využití látek auxotrofie anaerobní růst U kvasinek testování kvasných schopností zda vůbec které sacharidy Produkce extracelulárních enzymů

Imunologické metody Reakce s protilátkami Hlavně u patogenních MO U některých druhů MO dělení na tzv. sérotypy (sérovary)

Biochemické metody Různé látky mají různou strukturou a zastoupení u různých skupin MO Spektrum = procentuální zastoupení jednotlivých složek směsi identifikačních látek Markery = látky vyskytující se jen u určité skupiny organismů např. ergosterol u hub Fingerprint = otisk palce metoda, která umožňuje jednoznačnou identifikaci MO dle skupiny látek

Profily mastných kyselin Složení membránových mastných kyselin závisí na: taxonomické skupině teplotě složení média Za konstantních podmínek je možné profily MK použít k identifikaci

Profily mastných kyselin Kultivace MO za definovaných podmínek chudé médium konstantní teplota Izolace lipidů Rozklad lipidů Esterifikace MK =zvýšení těkavosti Analýza na plynovém chromatografu

Společenstva Extrakce fosfolipidů z přírodního materiálu (půda, listí…) Rozklad fosfolipidů Chromatografické měření spektra zastoupení jednotlivých MK odpovídá přítomnosti určitých skupin MO houby, bakterie, G+, G-, mykorhizní houby… např. suma 10Me16:0, 10Me17:0, 10Me18:0 odpovídá zastoupení aktinomycet

Pyrolýza Fingerprint metoda pro identifikaci druhu (kmene) popř. společenstva Zahřátí kultury MO na cca 1000°C rozklad organických látek Analýza kapalinovou chromatografií

Genetické metody Nejperspektivnější Rychlý rozvoj Zohledňují fylogenetické vztahy  možnost zařazení do taxonomického systému Možnost izolace úseků DNA specifických pro určité taxonomické skupiny MO (bakterie, houby, G+…) Obvykle fingerprint metody