Plazmatické proteiny Jana Švarcová

Plazmatické proteiny zahrnují proteiny krevní plazmy a intersticiální tekutiny většina syntetizována v játrech a secernována do krve většinou jde o glykoproteiny – drsné EPR (kromě Alb a CRP) N-glykoproteiny – asparagin – váže se celý oligosacharid najednou O-glykoproteiny – OH skupina serinu a threoninu – muciny a proteoglykany

Plazmatické proteiny

Plazmatické proteiny celková koncentrace bílkovin - více než 300 proteinů – sérum: 62 – 82 g/l – výrazně se nemění 35 – 50 g/l albumin 20 – 35 g/l sérové globuliny (transportní proteiny, reaktanty akutní fáze, globuliny) – v plazmě konc. vyšší o koagulační faktory – hypoproteinemie – hromadění tekutin v extravaskulárním tkáňovém prostoru → edém; malnutrice – hyperproteinemie - dehydratace

Plazmatické proteiny – funkce I. udržování koloidně osmotického tlaku – distribuce tekutin mezi krví a tkáněmi koloidně osmotický tlak brání pronikání nadbytečné intravaskulární kapaliny do extravaskulárního tkáňového prostoru → zabránění vzniku otoků transport látek - albumin – mastné kyseliny, bilirubin, vápník, léky - transferin – železo - ceruloplazmin – měď - transkortin – kortisol, kortikosteron - lipoproteiny – lipidy - haptoglobin – volný hemoglobin - thyroxin vázající globulin – thyroxin - retinol vázající protein – retinol

Plazmatické proteiny – funkce II. hemokoagulace, fibrinolýza faktory účastnící se procesu krevního srážení - IX, VIII, trombin, fibrinogen zvýšená koncentrace těchto faktorů či jejich nedostatek vede ke vzniku chorob – hemofilie, tvorba krevní sraženiny antikoagulační aktivita plazmin - odbourání trombinu, rozpouštění krevní sraženiny

Plazmatické proteiny – funkce III. Obranné reakce organismu specifická a nespecifická imunita imunoglobuliny – odstranění antigenů komplementový systém – odstranění buněčných antigenů akutní fáze zánětu - α1-antitrypsin, α1-kyselý glykoprotein, haptoglobin, α2-makroglobulin funkce enzymů a inhibitorů tvorba komplexů s enzymy a jejich odstranění inhibitory proteáz – bránící napadení poškozených a zanícených tkání proteolytickými enzymy (α1-antitrypsin, α2-makroglobulin, α1-antichymotrypsin) speciální funkce – např. ochrana před volnými radikály

Plazmatické proteiny – základní charakteristika biosyntéza - většina je syntetizována v játrech; lymfocyty (imunoglobuliny), enterocyty (apoprotein B-48) odbourávání – hepatocyty, mononukleární fagocytární systém (degradace komplexů např. antigen-protilátka, hemoglobin-haptoglobin)

Plazmatické proteiny – základní charakteristika většina je syntetizována v játrech syntetizovány ve formě pre-proteinů na membránově vázaných polyribosomech → posttranslační modifikace v ER a Golgiho komplexu ( „sekreční cesta“ = zrnitá endoplazmatická membrána → hladká endoplazmatická membrána → Golgiho aparát → plazmatická membrána → plazma) - pre-proteiny → proteiny - posttranslační modifikace – proteolýza, glykosylace, fosforylace charakteristický poločas trvání v oběhu (albumin: 20 dnů) vykazují polymorfizmus (imunoglobuliny, transferin, ceruloplazmin…)

Typy plazmatických bílkovin klasifikace podle elektroforetické pohyblivosti – agarózový nebo acetátcelulózový gel 5-6 frakcí albumin a pre-albumin globuliny alfa – α1 + α2 beta – β1 + β2 gama fibrinogen Albumin a1 a2 b1 b2 g hlavní proteiny jednotlivých frakcí

Typy plazmat. bílkovin – relativní rozměry a přibližné Mr měřítko 69 000 64 500 90 000 156 000 200 000 340 000 1300 000

Elektroforeogram – hlavní typy globulinů Zóna α1-globulinů - hlavním proteinem - α1-antitrypsin - zřetelné zesílení - při akutních zánětech Zóna α2-globulinů Haptoglobin - 6 fenotypů - lišící se elfo pohyblivostí. !!ALE: elfo stanovení neumožňuje rozlišení fenotypů haptoglobinu Zóna β1-globulinů - hlavním proteinem – transferin - intenzita zóny dobře koreluje s celkovou vazebnou kapacitou plazmy pro železo. Při anemii z nedostatku železa a v těhotenství se zvyšuje syntéza transferinu a intenzita zóny se zesílí. Zóna β2-globulinů - hlavním proteinem - C3 složka komplementu albumin orozomukoid a1-antitrypsin a1-antichymotrypsin ceruloplazmin a2-makroglobulin haptoglobin a-lipoprotein transferin hemopexin plazminogen fibronektin C3 komplement b-lipoprotein g-globuliny G – A – M – D – E

Elfo frakce plazmatických proteinů Zastoupení (%) c (g/l) Albuminy: albumin prealbumin (transthyretin) 52 – 58 34 – 50 1-globuliny: globulin vázající thyroxin, transkortin, 1-kyselý glykoprotein, 1-antitrypsin, 1-lipoprotein (HDL), 1-fetoprotein 2,4 – 4,4 2-4 2-globuliny: haptoglobin, makroglobulin, ceruloplasmin 6,1 – 10,1 5 – 9 -globuliny: transferin, hemopexin, lipoprotein LDL, fibrinogen, C-reaktivní protein, C3 a C4 složka komplementu 8,5 – 14,5 6 – 11 -globuliny: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 10 – 21 8 – 15

Proteiny akutní fáze (APRs) zánětlivé a stresové markery stimuly vedoucí ke změnám koncentrace APRs: lokální n. systémový zánět traumatická poškození tkání (vč. stavů po chirurg. výkonech) nádorová bujení reakce akutní fáze vyvolávají stavy, kdy dochází: k destrukci buněk, k reverzibilnímu poškození buněk a jejich následné reparaci k metabolické aktivaci některých buněk (imunitní odpověď) hladina se mění během akutního zánětu nebo nekrózy tkáně

Rozdělení reaktantů akutní fáze Pozitivní C-reaktivní protein složky komplementu (C3, C4) a1-antitrypsin, a1-anti-chymotrypsin, a2-makroglobulin haptoglobin, hemopexin, ferritin, ceruloplazmin sérový amyloid A (SAA) prokalcitonin fibrinogen TNF-a, IL-1, IL-6 Negativní albumin, prealbumin transferin antitrombin transkortin protein vázající retinol

Akutní zánětlivá odpověď odpověď organizmu na poškození tkáně cílem obranných rcí: ohraničení ložiska eliminace šíření patogenního agens stimulace přirozené a specifické imun. odpovědi reparace poškozené tkáně ⇒ zničení cizorodých substancí nebo mikroorganizmů Spouštěcí mechanizmy akutní zánětlivé odpovědi fyzická aktivita bakteriální a virové infekce trauma tkáňový stres tepelný stres autoimunitní onemocnění

Akutní zánětlivá odpověď Poškození tkáně Infekce, autoimunitní reakce LOKÁLNÍ ZÁNĚTLIVÁ REAKCE Aktivace monocytů (makrofágů), destiček Uvolnění TNFα, IL-1, IL-6, IL-8, TGFβ, PLA2 SYSTÉMOVÁ REAKCE Krev Leukocytóza Horečka Nadledviny Játra Kostní dřeň Imunitní systém Kortizol ACTH Proteiny akutní fáze Hypotalamus

Význam pozitivních reaktantů akutní fáze I. Složky imunitní reakce - likvidace noxy, která způsobila zánět, úloha při odstraňování poškozených buněk, nebo modulují imunitní reakci – CRP, složky komplementu (C3 a C4), TNF-a, Il-1, Il-6 Ochrana před kolaterálním poškozením tkáně: - především z fagocytů a rozpadajících se buněk se uvolňují látky, které mají zničit noxu, jež vyvolala zánět. Jde hlavně o proteolytické enzymy a reaktivní formy kyslíku ⇒ je nutno omezit účinek těchto látek (aby působily jen tam, kde mají a aby poškození tkáně bylo co nejmenší) - inhibitory proteáz - likvidace proteolytických enzymů a1-antitrypsin, a1-antichymotrypsin, a2-makroglobulin - bílkoviny, které snižují tvorbu a dostupnost ROS a bílkoviny stabilizující přechodné kovy a jejich komplexy haptoglobin hemopexin feritin ceruloplazmin

Význam pozitivních reaktantů akutní fáze II. Transport odpadních látek vznikajících během zánětu hemoglobin hemopexin sérový amyloid A (SAA) Koagulační faktory a bílkoviny podílející se na regeneraci tkáně: fibrinogen prokalcitonin prothrombin von Willebrandtům faktor plazminogen

Význam negativních reaktantů akutní fáze kritérium syntézy bílkovin v játrech a jako ukazatel malnutrice

Reaktanty akutní fáze – rychlost změn koncentrace podle doby od začátku onemocnění – 3 skupiny: časné proteiny akutní fáze – velmi krátký biolog. poločas změny plazmat. konc. – 6-10 hod. od začátku onemocnění CRP, SAA, prokalcitonin APRs se střední dobou odpovědi – změny konc. – 12-36 hod. od začátku onemocnění a1-kyselý glykoprotein, a1-antitrypsin, haptoglobin, fibrinogen pozdní proteiny akutní fáze – změny konc. 48-72 hod. od začátku onemocnění složky komplementu C3, C4; ceruloplazmin

C-reaktivní protein (CRP) patří mezi b2-globuliny (Mr 111 000 Da) koncentrace v plazmě 1,5 – 5 mg/l precipituje C-polysacharid pneumokoků fyziologická role - aktivace komplementového systému, hraje úlohu opsoninu  vazba na fosfocholin na povrchu odumřelých buněk (a některých bakterií) plazmatická koncentrace  již za 4 hod po navození reakce akutní fáze (během prvních dnů – konc.  více než 100× diferenciace mezi bakteriálním a virovým horečnatým onemocněním monitorování léčby antibiotiky – úspěšná terapie → rychlý pokles CRP obecně : akutní onemocnění (např. infarkt myokardu, hluboká žilní trombóza, infekce bakteriemi, viry, mykotická infekce) chronický stav (např. malignita, revmatické choroby, malignita, nekróza tkáně, zánětlivé střevní onemocnění)

Prokalcitonin (PCT) 116 AMK (Mr 13 000 Da) fyziologicky tvořen C-buňkami štítné žlázy jako prekurzor kalcitoninu : preprokalcitonin (141 AMK) → odštěpení signálního peptidu (25 AMK)→ prokalcitonin (116AK) zvýšení v plazmě po 2 hodinách, maximum 6-8 hodin, zvýšené hladiny až 72 hodin sekrece je stimulována bakteriálními endotoxiny přesný fyziologický význam není objasněn – předpoklad – podílí se na regulaci zánětu a má analgetické účinky indikátor časné sepse – PCT uvolněný při sepsi není konvertován na kalcitonin šokové stavy, orgánová selhání bakteriálního původu, sepse

Sérový amyloid A (SAA) protein akutní fáze vázaný na HDL = souhrnný název pro skupinu plazmatických lipoproteinů, součást HDL prekurzor amyloidu A syntéza – hepatocyty, aktivované makrofágy a fibroblasty. Stimulem pro syntézu jsou TNF, IL 1 a 6 časný marker zánětu – zvýšení do 8 hod. V porovnání s CRP - SAA častěji zvýšen i u méně závažných infekcí a je výrazně zvýšen i při virových infektech Význam: vlastní biologická funkce není spolehlivě známá zánětlivý marker u infekčních onemocnění marker rejekce štěpu prognostický marker u kardiovaskulárních onemocnění chronicky zvýšené hladiny SAA byly zjištěny u revmatoidní artritidy, tuberkulózy, lepry Předpokládá se, že přispívá k: indukci syntézy kolagenázové aktivity inhibici agregace trombocytů podílí se na snížení transportu HDL cholesterolu do jater

a1-antitrypsin (a1-antiproteináza) hlavní globulin a1 frakce (90 %) (Mr 52 000 Da) koncentrace v plazmě 0,9 – 2 g/l syntetizován v hepatocytech a makrofágách glykoprotein, vysoce polymorfní Funkce: hlavní plazmatický inhibitor serinových proteáz (trypsinu, elastázy...) během akutní fáze se zvyšuje  zamezení odbourání pojivové tkáně elastázou (elastáza neutrofilů v plicní tkáni – za fyziolog. podm. - součástí ochrany organismu při poranění a zánětu, ale zároveň je svou proteolytickou aktivitou nebezpečná pro plicní tkáň) deficience  proteolytické poškození plic (emfyzém) vazby s proteázami se účastní methionin; při kouření – Met oxidován  inaktivace AT; AT přestává inhibovat  ↑ proteolytické poškození plic, zvláště u pacientů s deficiencí AT. – akutní záněty, nádory, akutní i chronická hepatopatie, cirhózy – glomerulonefritidy, revmatoidní artritidy, genetické příčiny

Haptoglobin (Hp) 2- globuliny (Mr 85 000 – 1 000 000 Da), tetramer α2β2 řetězců koncentrace v plazmě 0,4 – 1,8 g/l existují 3 typy alfa řetězců, proto se vyskytuje ve 3 poly-morfních formách Funkce: váže volný hemoglobin a transportuje jej do retikulo-endoteliálních buněk komplex Hb-Hp neprochází glomeruly (Mr 155 000)  zamezení ztráty volného Hb, a tudíž i Fe volný Hb prochází glomeruly a precipituje v tubulech  poškození ledvin – záněty, infekce, poranění, maligní nádory – hemolytické anemie - biolog. poločas Hp ≈ 5 dnů x komplex Hp-Hb - 90 min (komplex je z plazmy rychle odstraňován hepatocyty)  hladina Hp klesá za situací, kdy je Hb soustavně uvolňován z červených krvinek (hemolytická anemie)

a2-makroglobulin 2- globuliny (Mr 720 000 Da); tetramer – 4 stejné podj. koncentrace v plazmě -1,3 – 3 g/l rodina thiolesterových plazmatických bílkovin – velmi reaktivní vnitřní cyklická vazba ⇒ biolog. fce a2-makrogl. a2-makroglobulin váže mnoho proteáz (= důležitý panproteázový inhibitor) ALE také transport cytokinů a růstových faktorů díky velmi vysoké molekulové hmotnosti neprojde ani nepoškodí glomerulární membránu - akutní zánět, nefrotický sy., revmatoidní artritida, parodontosa (v tekutině gingiválních štěrbin), Crohnova choroba a ulcerosní kolitida - progrese rakoviny prostaty pozn.: v mozcích pacientů s Alzheimerovou chorobou - a2M lokalizován do amyloidních plak a váže také rozpustný b-amyloid

Ceruloplazmin a2- globuliny (Mr 160 000) koncentrace v plazmě 0,3 gl 1 molekula ceruloplazminu váže 6 atomů mědi Funkce: přenáší 90 % plazmatické mědi (měď – kofaktor různých enzymů) ⇒ modré zbarvení Alb – vazba mědi mnohem slaběji; pro transport mědi důležitější! (10 %; snadněji uvolňuje měď tkáním)

Ceruloplazmin nízké koncentrace: onemocnění jater Wilsonova choroba - (převážně geneticky zapříčiněný defekt Cp. – mutace genu pro měď vázající ATPázu (P-typ) ⇒ porucha exkrece mědi do žluče a inkorporaci mědi do apoceruloplasminu v hepatocytech ⇒ hromadění mědi, především v játrech a mozku + Kayser-Fleischerův prstenec = zelený či zlatý prstenec kolem rohovky ) Menkesova choroba – (dědičnost vázána na chromozom X ⇒ postiženi pouze kojenci - chlapci; věk 2−3 měsíců, postižení umírají většinou do tří let po narození. Neurodegenerativní onemocnění - křeče a hypotonie. Mutace genu ⇒ neschopnost buněk střevní sliznice přenášet Cu přes membránu do krevní cirkulace) nízká hladina mědi v důsledku malnutrice

Transferin (Tf) patří mezi b1-globuliny (Mr 76 000 Da) koncentrace v plazmě 3 gl syntetizován v játrech; až 20 polymorfních forem Funkce: centrální úloha v metabolizmu železa transport železa – z odbouraného hemu a z potravy (střeva) do místa potřeby, tj. do kostní dřeně a dalších tkání 1 molekula transferinu váže max. 2 molekuly Fe3+ každý den – degradace cca 1 miliarda RBC (≈20 ml) → uvolněno 25 mg železa (naprostá většina transportována Tf) Za fyziologických podmínek je celková vazebná kapacita transferinu (total iron-binding capacity – TIBC) nasycena železem asi z 1/3. Zbytek nazýváme volná vazebná kapacita (latent iron-binding capacity – LIBC)

Transferin (Tf) Receptory pro transferin (TfR) – na povrchu mnoha buněk (prekurzory krevní řady v kostní dřeni) → vazba Tf – dochází k endocytóze komplex je internalizován do endo- somu Kyselé pH v lyzosomu → následná disociace železa a transferinu (redukce Fe3+  Fe2+) - Fe se dostává do cytoplasmy - železo je dopraveno do místa potřeby v buňce resp. navázáno na feritin (Fe2+  Fe3+ ) a uskladněno - apotransferin (apoTf) není degradován, ale vrací se do plazmat. membrány, uvolňuje se z receptoru a vstupuje zpět do plazmy cyklus- opakování 10-20 × denně → Tf může znovu vázat Fe a transportovat jej k buňkám

Transferin (Tf) Volné ionty Fe2+ jsou pro organismus toxické – katalyzují Fentonovu reakci (vznik vysoce toxického OH radikálu): H2O2 + Fe2+ → OH- + ˙OH + Fe3+ Transferin spolu s dalšími bílkovinami plasmy, které váží železo nebo hem, působí jako antioxidant (zabraňuje vzniku ROS). Příčiny poklesu Tf: popáleniny, infekce, maligní procesy, onemocnění jater a ledvin Příčiny relativního nadbytku Tf: anémie z nedostatku železa

Fibrinogen Glykoprotein, patří mezi b2-globuliny (Mr 340 000 Da) koncentrace v plazmě 1,5 – 4,5 g/l součást koagulační kaskády = koagulační faktor I, prekurzor fibrinu symetrický dimer složený ze tří párů řetězců Při elektroforéze plazmy se pohybuje mezi β- a g-globuliny Funkce: během hemokoagulace – aktivace (přeměna) na nerozpustný a polymerující fibrin, je způsobena proteázou trombinem je také mediátorem agregace krev. destiček - akutní zánět, poškození tkán; rizikový faktor aterosklerózy - nedostatečná tvorba fibrinogenu (těžké hepatopatie) nebo při jeho neúměrně zvýšené spotřebě (diseminovaná intravaskulární koagulace - DIC)

Imunoglobuliny Ag NH2 NH2 Protilátky produkované B-buňkami jako odpověď organizmu na stimulaci antigenem Reagují specificky s antigenními determinanty (epitop) Struktura: tetramer 2 těžké (H) a 2 lehké (L) řetězce spojené disulfidickými můstky lehké řetězce obsahují konstantní oblast (C) a variabilní oblast (V) COOH COOH IgG

Albumin hlavní bílkovina plazmy - 55-65 % celk. plazmat. bílkovin (Mr 69 000 Da) koncentrace v plazmě 34-47 gl syntéza v játrech závisí na přijmu aminokyselin biologický poločas – 20 dní. Odbourávání – endotel kapilár Funkce: udržování onkotického tlaku plazmy (75-80 %) (hodnoty ↓ než 20 g/l – edémy) proteinová rezerva organizmu a slouží jako zdroj AMK (esenciálních) pro různé tkáně transport steroidních hormonů žlučových kys. a volných mastných kyselin (stearová palmitová, olejová) bilirubinu léků (sulfonamidů, salicylátů) Ca2+, Mg2+ Cu2+, Zn2+

Albumin syntetizován jako preproalbumin Alb – řetězec 585 AMK, 17 disulfid. vazeb působením proteáz se štěpí na 3 domény s rozdílnými funkcemi elipsoidní tvar molekuly – nezvyšuje viskozitu plazmy X fibrinogen preproalbumin proalbumin signální peptid hexapeptid albumin + furin peptidáza

Snížená koncentrace Alb - příčiny pokles syntézy v játrech proteinová podvýživa onemocněních jater (jaterní cirhóza) + alkoholizmus nízký poměr Alb/globuliny zvýšená ztráta proteinů ledviny – onemocnění ledvin a nefritidy trávicí trakt - záněty střev nebo celiakie masivní popáleniny – velká ztráta Alb kůží negativní reaktant akutní fáze ⇒ pokles koncentrace Alb (= zvýšený katabolizmus) - příznak akutních zánětů, akutních stavů nebo nádorů analbuminémie - defekt syntézy albuminu koncentrace Alb < 2,0 g/l

Elektroforéza sérových bílkovin za některých patologických stavů Akutní zánět – zvýší se syntéza reaktantů akutní fáze (a1 a a2 frakce) akutní fáze infekčních onem. akutní poškození tkáně větší popáleniny Chronický aktivní zánět – zvýší se syntéza imunoglobulinů B-buň-kami (g-frakce polyklonálních Ab) revmatoidní artritida Hypogamaglobulinemie – snížená syntéza Ig (g oblast) 1° a 2° deficit tvorby Ab ztráty imunoglobulinů

Elektroforéza sérových bílkovin za některých patologických stavů Jaterní cirhóza –snižuje se syntéza albuminu a bílkovin v hepatocytech nadměrná tvorba Ig - někdy se neoddělí b a g frakce (b-g můstek díky zvýšenému IgA) chronická jaterní onemocnění Alfa-1 antitrypsin deficience – genetický defekt působící chybění a1-antitrypsinu Monoklonální gamapatie – mnohočetný myelom, nádorové bujení plazmatických buněk benigní monoklonální gamapatie maligní monoklonální gamapatie (myelom)