SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ INFEKČNÍCH NEMOCÍ

LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA INFEKČNÍCH NEMOCÍ: PŘÍMÝ PRŮKAZ MIKROORGANISMU NEBO JEHO PRODUKTU kultivace mikroskopie PCR

Dynamika protilátkové odpovědi IgG x IgM NEPŘÍMÝ (SÉROLOGICKÝ) PRŮKAZ Stanovení protilátek obtížně kultivovatelné bakterie (lues, borelie aj.) retrospektivní nález (epidemiologie) Dynamika protilátkové odpovědi IgG x IgM

DYNAMIKA PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI čas IgG IgA IgM Množství protilátek

TECHNIKY SÉROLOGICKÉHO PRŮKAZU DVOJITÁ IMUNODIFÚZE (OUCHTERLONY) INFEKČNÍCH NEMOCÍ: DVOJITÁ IMUNODIFÚZE (OUCHTERLONY) precipitace v gelu v Petriho miskách do gelu difunduje proti sobě Ag a Ab v bodě ekvivalence vzniká precipitační linie kvalitativní průkaz příklady použití: systémové kandidózy (C. albicans, krusei) aspergilózy (A. flavus, fumigatus, niger, terreus)

PRECIPITACE V GELU

korpuskulární antigen AGLUTINACE korpuskulární antigen reakce Ag s Ab se projeví jako viditelný aglutinát důležitá je příprava antigenu: kultivace mikroba, promytí suspenze, nastavení optim. hustoty, inaktivace (teplota, fenol ...) použití: průkaz protilátek identifikace mikroba známým antisérem provedení: mikrotitrační destičky zkumavky kvantitativní stanovení - ředění séra geometrickou řadou titr = převrácená hodnota nejvyššího ředění séra, které ještě dává pozitivní reakci (ředění 1:160 = titr 160) sledování dynamiky titrů !

ŘEDĚNÍ SÉRA

PŘÍKLAD AGLUTINAČNÍ TECHNIKY V DESTIČCE

AGLUTINACE příklady použití aglutinace: Listerióza (L. monocytogenes) (sérotyp O-I, II nebo O-V) hodnocení: titr>160, dynamika (párové vzorky) Tularémie (Francisella tularensis) hodnocení titr>20, dynamika (párové vzorky) Pertuse, parapertuse (Bordetella pertussis, parapertussis) hodnocení: očkování ! (směrodatný je min. 4-násobný vzestup nebo pokles titrů)

AGLUTINACE Brucelóza (Brucella abortus) inkompletní (blokující) protilátky - váží se na Ag ale neaglutinují ho Coombsův test (s antiglobulinovým sérem) chronické stadium infekce

Salmonelózy (Salmonella sp.) - Widalova reakce sérotypy AGLUTINACE Salmonelózy (Salmonella sp.) - Widalova reakce sérotypy antigeny O – somatické antigeny H – bičíkové Vzhled aglutinátu kompaktní, zrnitý - Ab proti O (somatickým) Ag chomáčkovitý (roztřepatelný) – Ab proti H (bičíkovým) Ag antigen Vi (povrchový, polysacharidový – stnovuje se jinou metodou - hemaglutinací) Kaufmannovo-Whiteovo diagnostické schéma provedení ve zkumavkách hodnocení: titr>80, dynamika

AGLUTINACE

NEPŘÍMÁ HEMAGLUTINACE bakteriální Ag je navázán na zvířecích erytrocytech (nosič) polysacharidové Ag se váží přímo proteinové Ag se váží po opracování (tanin, CrCl3) kvantitativní test (titr) příklady použití: Yersinia enterocolitica (O3), Yersinia pseudotuberculosis syfilis (Treponema pallidum, TPHA) Salmonella typhi (Vi Ag)

NEPŘÍMÁ HEMAGLUTINACE

PŘÍKLAD VÝSLEDKU HEMAGLUTINAČNÍ TECHNIKY

TEST INHIBICE HEMOLÝZY (NEUTRALIZAČNÍ TEST) ASO (antistreptolysin O, ASLO) infekce Streptococcus pyogenes ( hemolytický streptokok skupiny A) sterilní následky streptokokových nákaz (revmatická horečka, glomerulonefritida) provedení: SLO (streptolysin O) hemolyzuje erytrocyty in vitro, v přítomnosti protilátek dochází k zábraně hemolýzy - test inhibice hemolýzy (neutralizační test) kvantitativní test (Uml) hodnocení: >200, dynamika (párové vzorky) alternativa – stanovení ASO nefelometricky

STREPTOLYZIN (ASLO) - inhibice hemolýzy

NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE protilátková odpověď v jednotlivých třídách Ig (IgM, IgG) kvalitativní provedení (základní ředění séra) kvantitativní provedení (titry) příklady použití: borelie syfilis - FTA-ABS

NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE

ENZYMOVÁ IMUNOSORPČNÍ ANALÝZA (ELISA) Lze využít jak pro stanovení protilátek (v izotypech IgG, IgM aj.) tak pro stanovení antigenu komplex Ag - Ab detekován sekundární protilátkou značenou enzymem (křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza) komplex Ag – Ab je vázán na imunosorbent, nenavázané Ag (Ab) se odstraní promytím Ag: celobuněčný lyzát (rozbití ultrazvukem, hypotonické prostředí, zmražování - rozmražování), bakteriální exoprodukty, rekombinantní Ag aj. protilátková odpověď v jednotlivých třídách Ig (IgG, IgM) vysoká citlivost (1ng/l) hodnocení testu kvalitativní (hraniční sérum, cut-off) kvantitativní (kalibrační křivka)

ENZYMOVÁ IMUNOSORPČNÍ ANALÝZA (ELISA) příklady použití ELISA technik protilátky proti Helicobacter pylori protilátky proti borelióze (B. burgdorferi, garinii, afzelii) protilátky proti virovým infekcím (herpetické viry, hepatitidy, HIV a mnoho jiných) přímý průkaz Ag (HBsAg, HIV)

ELISA – průkaz specifických protilátek

ELISA – průkaz antigenu

IgM „capture“ – průkaz specifických protilátek IgM proti infekčnímu agens (odstranění vlivu specifických IgG protilátek)

TYPICKÝ VÝSLEDEK STANOVENÍ SPECIFICKÝCH PROTILÁTEK TECHNIKOU ELISA

WESTERN BLOT (IMUNOBLOT) průkaz přítomnosti protilátek proti jednotlivým Ag (bakteriálním, autoantigenům, ...) krok - elektroforéza proteiny ve směsi se rozdělí podle mol. hmotnosti na polyakrylamidovám gelu v přítomnosti SDS (dodecylsíran sodný – anionický detergent) - udělí proteinům záporný náboj 2. krok - blotování transport proteinů z gelu na nitrocelulózovou membránu v elektrickém poli

WESTERN BLOT (IMUNOBLOT) 3. krok - imunodetekce přidání vzorku (sérum pacienta s IgG proti antigenům B. burgdorferi) přidání sekundární protilátky (zvířecí antisérum proti lidskému IgG značené Px) přidání substrátu (v místě vazby specifické protilátky na Ag vzniká barevná reakce) 4. krok - vizuální hodnocení přítomnosti (intenzity) barevné reakce u specifických bakteriálních Ag

WESTERN BLOT (IMUNOBLOT) příklady použití: borelióza (B. burgdorferi) – konfirmace výsledků testu ELISA Helicobacter pylori – sérologický průkaz infekce kmeny s vyšším patogenním potenciálem (CagA antigen) AIDS (HIV) konfirmace ELISA technik

WESTERN BLOT (IMUNOBLOT)

WESTERN BLOT (IMUNOBLOT)

IMUNOBLOTOVÁ ANALÝZA PROTILÁTEK PROTI BORRELIA BURGDORFERI POZITIVNÍ KONTROLA KLINICKÉ VZORKY IgM IgG

SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ SYFILIS 1. vyhledávací (screeningové) testy krevní dárci, dárci orgánů, těhotné, podezření na syfilis 1.1. Rychlá reaginová reakce (RRR, RPR, VDRL) netreponemový test reaginy (Ab proti Ag lipidového charakteru - kardiolipin) nepřímá aglutinace – nosič Ag uhlíkové částice provedení na sklíčku, papírové kartičce, v destičce hodnocení kvalitativní, titry reakce 2-3 týdny od počátku infekce, titry reagují na léčbu

SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ SYFILIS 1.2. TPHA treponemový test nepřímá hemaglutinace s antigenem T. pallidum navázaným na zvířecí erytrocyty kvalitativní test (základní ředění 1:80) zůstává pozitivní celý život

SÉROLOGICKÝ PRůKAZ SYFILIS 2. Konfirmační testy 2.1.FTA-ABS nepřímá imunofluorescence Ag T. pallidum – Nicholsův kmen nutno předem vysytit séra sorbentem (ABS) sorbent – vysytí protilátky proti nepatogenním treponemám (T. macrodentium, refringens, denticola, orale) hodnocení: titry IgG x IgM (časná infekce, vrozená syfilis)

SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ SYFILIS (FTA-ABS)

SÉROLOGICKÝ PRŮKAZ SYFILIS 2.2. ELISA test specifický antigen navázaný na destičku IgG x IgM odpověď 2.3. TPI (imobilizační test) provádí referenční laboratoř Praha suspenze živých treponem + sérum (Ab) + komplement pozitivní výsledek = imobilizace 50% treponem především diagnostika pozdní (neléčené) syfilis