PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO Stresové situace, se kterými se celistvá rostlina vypořádá, není často explantát schopen řešit a zvládnout. Potřebné chemické sloučeniny, které je celistvá rostlina schopna syntetizovat v dostatečném množství a transportovat na místo určení, mohou být explantátem syntetizovány v nedostatečné míře nebo vůbec (je třeba dodat z vnějšku). Nutnost indukce organogenních změn vyžaduje zabezpečení indukčních podmínek jak fyzikálních, tak chemických. Kultury vyžadují pro svůj zdárný vývoj specifické podmínky Nutnost věnovat značné úsilí a péči stanovení optimálních podmínek, které vedou k požadovanému růstu a vývoji kultur in vitro.  Teplota  Světlo  Vlhkost  Složení plynné fáze  Složení médií  Aseptická kultivace  Ošetření mateřských rostlin  Typ explantátu

TEPLOTA Př: Vývoj embryí olivy: Teploty vyšší X in vivo : r. mírného pásma  25 °C (rozmezí 17-28 °C), r. tropické a subtropické  28 °C (24 -32 °C) Stejná teplota noc a den (ale někdy denní změny teplot - denní o něco vyšší než optimální teplota in vivo, noční o 4 -8 °C méně než denní) změny teplot vedou k výměně vzduchu mezi vnitřkem nádoby a okolím. Skleníkový efekt Nadzemní části X kořeny téhož druhu -- kořeny optimum při nižších teplotách Různé druhy různě výrazná teplotní optima, někdy i různé variety téhož druhu % Př: Vývoj embryí olivy: 100 50 °C 20 25 30 Př: Vývoj vzrostných vrcholů broskvoní: 21-24 °C --- 80-90 % vykazuje růst 28 °C --- 7 % vykazuje růst Př: Růže - množení výhonů -většinou kolem 18 °C, ale některé hybridy - optimum 12 °C, jiné 24 °C Př: Řepka : segmenty květní stopky nekoření pod 13 °C

Rychlost růstu TEPLOTA  teploty pod optimem  rychlost růstu pomalu klesá,  teploty nad optimem  rychlý pokles růstové rychlosti. Množení ze segmentů může mít odlišná optima od optim de novo regenerace pupenů a SE Někdy funguje při organogenezi předpůsobení při nízkých teplotách Př. Kalus Arabidopsis: 3-6 dní při 4 °C a pak přenesení na indukční médium  zvýšení tvorby pupenů i kořenových základů. Teplotní podmínky mateřských rostlin In vitro produkované hlízky nebo cibulky jsou často dormantní. K překonání dormance vede působení nízkými teplotami 1-10 °C. °C

Energetické jednotky SVĚTLO Množství zářivé energie emitované ze zdroje za jednotku času Zářivý tok ( radiant flux) [J.s-1=W; (erg.s-1)] Zářivý tok. plošná jednotka –1 Hustota zářivého toku ( radiant flux density) [W.m-2] Zářivý tok zachycený na jednotku plochy Plošná hustota zářivého toku, ozáření ( radiant flux density at a surface  irradiance) [W.m-2] Energetický výdej bodového zdroje Intenzita záření ( radiant intensity), energie emitovaná za jednotku času (zářivý tok) na 1 steradián (zářivý tok bodového zdroje o intenzitě 1W.sr-1 = 4W)

Světelné jednotky – definovány analogicky SVĚTLO Energetické jednotky Množství zářivé energie emitované ze zdroje za jednotku času Zářivý tok ( radiant flux) [J.s-1=W; (erg.s-1)] Zářivý tok. plošná jednotka –1 Hustota zářivého toku ( radiant flux density) [W.m-2] Zářivý tok zachycený na jednotku plochy Plošná hustota zářivého toku, ozáření ( radiant flux density at a surface  irradiance) [W.m-2] Energetický výdej bodového zdroje Intenzita záření ( radiant intensity), energie emitovaná za jednotku času (zářivý tok) na 1 steradián (zářivý tok bodového zdroje o intenzitě 1W.sr-1 = 4W) Světelné jednotky – definovány analogicky Světelný tok ( luminous flux) [lumen, ln] Hustota světelného toku ( luminous flux density) [ln .m-2; lux] Plošná hustota světelného toku, osvětlení ( luminous flux density at a surface  illumination) [ln .m-2; lux] Intenzita světla ( luminous intensity) [ln.sr-1; cd]

Kvantové jednotky W.m-2 X mol.s-1.m-2 X lux SVĚTLO Zářivá energie emitována v diskrétních kvantech – fotonech. Množství kvant – měřeno v molech (Einsteinech, 1E=6,023.1023 kvant) Fotonový tok [mol.s-1] Hustota fotonového toku [mol.s-1.m-2] Plošná hustota fotonového toku ozáření [mol.s-1.m-2] Převádět ozáření na plošnou hustotu fotonového toku lze jen pro určitou . Všechny převody mezi světelnými a energetickými jednotkami jsou jen přibližné !! W.m-2 X mol.s-1.m-2 X lux

uv Pfr (aktivní forma) Pr SVĚTLO  Teplota  Světlo  Vlhkost  Složení plynné fáze  Složení médií  Aseptická kultivace  Ošetření mateřských rostlin  Typ explantátu Růst a vývoj jsou závislé na světle prostřednictvím: 1. Fotosyntézy 2. Fotomorfogeneze 3. Fototropismu 1.Rychlost fotosyntézy in vitro – často relativně nízká závislost na exogenním cukru nezelené kultury; mixotrofie;  CO2 - autotrofie 2.Fotomorfogeneze - významná in vitro Pfr (aktivní forma) Fytochrom Pr 660 nm 730 nm (Prodloužená temnotní fáze) Účinnostní spektrum světla při fotosyntéze červené Modré uv BLP, kryptochrom 300 400 500 600 700 800

Vlnová délka Důležitá je tedy kvalita světla: a) Vlnová délka SVĚTLO Důležitá je tedy kvalita světla: a) Vlnová délka b) Trvání expozice - fotoperioda c) Ozáření (osvětlení) Vlnová délka Fotosynteticky aktivní záření Morfogeneticky aktivní záření Oblast červeného světla Oblast modrého světla Oblast UV

=420 nm =370 nm (UV) Vlnová délka tma SVĚTLO Důležitá je tedy kvalita světla: a) Vlnová délka b) Trvání expozice - fotoperioda c) Ozáření (osvětlení) Vlnová délka Fotosynteticky aktivní záření Morfogeneticky aktivní záření Oblast červeného světla Oblast modrého světla Oblast UV =420 nm Př.: tabáková tkáňová kultura =370 nm (UV) tma 100 lx 500 lx 1-2000 lx

Př: segment vrby a) Vlnová délka cytokinin cytokinin SVĚTLO a) Vlnová délka Př: segment vrby cytokinin cytokinin  rychlosti růstu kalusů: často modré světlo  růstu axilárních pupenů: červené světlo//cytokinin  klíčení semen: červené světlo//cytokinin  tvorby cibulek červené světlo//cytokinin  kořenění červené světlo / dl. červené  tvorba chlorofylu: většinou červené světlo indukce tvorby chloroplastů modré světlo Indukce specifické enzymové aktivity závislá na vlnové délce Př: tvorba sekundárních metabolitů petržele --- ozáření UV světlem  = 290nm Hořec –  růst rostlin červené světlo,  produkce hořkých glykosidů dl. červené a modré

Produkce fenolických látek: vliv světla Deschampsia antarctica Sequeida et al., 2012

 některé vlivy mohou být nahrazeny přidáním růstových regulátorů SVĚTLO Důležitá je kvalita světla: a) Vlnová délka b) Trvání expozice - fotoperioda c) Ozáření (osvětlení) b) Trvání expozice - fotoperioda Ovlivňuje rostliny Fotoperiodismem Množstvím přijatého světla Délka dne může ovlivnit hladiny fytohormonů (dlouhý den  hladiny auxinů)  některé vlivy mohou být nahrazeny přidáním růstových regulátorů Růst výhonů X kvetení – různá optimální délka dne Př: Kultura výhonů okurky - pozitivní ovlivnění: růst výhonů-dlouhý den X kvetení - krátký den Př: Kultura stonkových segmentů bramboru: dlouhý den prorůstání pupenů, krátký den tuberizace Interakce délka dne X teplota

 některé vlivy mohou být nahrazeny přidáním růstových regulátorů SVĚTLO b) Trvání expozice - fotoperioda Ovlivňuje rostliny Fotoperiodismem Množstvím přijatého světla Délka dne může ovlivnit hladiny fytohormonů (dlouhý den  hladiny auxinů)  některé vlivy mohou být nahrazeny přidáním růstových regulátorů Růst výhonů X kvetení – různá optimální délka dne Př: Kultura výhonů okurky - pozitivní ovlivnění: růst výhonů-dlouhý den X kvetení - krátký den Př: Kultura stonkových segmentů bramboru: dlouhý den prorůstání pupenů, krátký den tuberizace Interakce délka dne X teplota

Morfogeneze a růst výhonů Fotoperioda Př: Kultury vrcholků pelargonií - podpořeny v růstu a tvorbě mnohonásobných výhonů - stálým světlem, osvětlení 500 lux Morfogeneze a růst výhonů Př: Tkáňové kultury pelargonií nezelenaly a netvořily náhradní pupeny při stálém světle - regenerace výhonů optimální při 16 h fotoperiodě Př: Listové segmenty begonií produkovaly náhradní pupeny, když buď segmenty nebo mateřské rostliny rostly při krátkém dni

Morfogeneze a růst výhonů Fotoperioda Př: Kultury vrcholků pelargonií - podpořeny v růstu a tvorbě mnohonásobných výhonů - stálým světlem, osvětlení 500 lux Morfogeneze a růst výhonů Př: Tkáňové kultury pelargonií nezelenaly a netvořily náhradní pupeny při stálém světle - regenerace výhonů optimální při 16 h fotoperiodě Př: Listové segmenty begonií produkovaly náhradní pupeny, když buď segmenty nebo mateřské rostliny rostly při krátkém dni In vivo probíhá iniciace a růst kořenů ve tmě. In vitro může docházet k ovlivnění světlem Př: Kdoulovec vyžaduje pro zakořenění výhonů světlo Růst kořenů Př: Kultury artyčoku a segmenty slunečnice lépe zakořeňují na světle

SVĚTLO c) Osvětlení, ozáření Osvětlení, stejně jako fotoperioda, ovlivňuje celkové množství přijaté energie  indukce tvorby chlorofylu, zvýšená aktivita klíčových enzymů fotosyntézy (! nízká úroveň fixace CO2)  stoupající produkce růstových inhibitorů, ovlivnění metabolismu růstových látek  inhibice růstu Optimální hodnoty ozáření se velmi liší pro různé explantátové kultury Vyšší hladiny ozáření často inhibují růst tkáňových kultur Možné důvody: Degradace B12  narušení replikace DNA Inhibice modrým světlem a UV   fenolických látek   biosyntézy giberelinů  syntézy cytokininů Zrychlení metabolismu IAA, světlo ovlivňuje oxidaci IAA Nutnost volby vhodného spektrálního složení světla, vhodné fotoperiody, vhodné hladiny osvětlení ( X technické problémy s udržením vhodné teploty)

SVĚTLO c) Osvětlení, ozáření Osvětlení, stejně jako fotoperioda, ovlivňuje celkové množství přijaté energie  indukce tvorby chlorofylu, zvýšená aktivita klíčových enzymů fotosyntézy (! nízká úroveň fixace CO2)  stoupající produkce růstových inhibitorů, ovlivnění metabolismu růstových látek  inhibice růstu Optimální hodnoty ozáření se velmi liší pro různé explantátové kultury Vyšší hladiny ozáření často inhibují růst tkáňových kultur Možné důvody: Degradace B12  narušení replikace DNA Inhibice modrým světlem a UV   fenolických látek   biosyntézy giberelinů  syntézy cytokininů Zrychlení metabolismu IAA, světlo ovlivňuje oxidaci IAA Nutnost volby vhodného spektrálního složení světla, vhodné fotoperiody, vhodné hladiny osvětlení ( X technické problémy s udržením vhodné teploty)

 Teplota  Světlo  Vlhkost  Složení plynné fáze  Složení médií  Aseptická kultivace  Ošetření mateřských rostlin  Typ explantátu VLHKOST Kultivace v uzavřených nádobách  vyšší relativní vlhkost - optimální vlhkost  70 % nižší vlhkost  vysychání média, špatný růst explantátů vyšší vlhkost  vitrifikace Příčiny vitrifikace vysoká relativní vlhkost  etylén  cytokininy ?? NH4+ Různé explantáty se velmi liší ve svých požadavcích !!! Př: explantáty hrušní - nezakořeňují při R.H.  95 % karafiáty – při R.H.  95 % vitrifikace  Nutnost snížit R.H., zvýšit výměnu vzduchu, snížit obsah cytokininů,… aplikace retardantů, změna složení média, obsah vitaminů… Vitrifikace  hyperhydricita Fyziologický stav: ztluštělé stonky i listy, světle zelené, křehké s abnormálním sklovitým vzhledem nadměrný příjem vody narušené stomatální uzavírání změny ve složení epikutikulárních vosků defektní kutikula redukovaná vodivá pletiva velké mezibuněčné prostory v houbovém parenchymu disbalance mezi buněčným dělením a diferenciací změny ve stavbě buněčných stěn velké vakuoly

SLOŽENÍ PLYNNÉ FÁZE Koncentrace plynů v pletivu závisí na :  Teplota  Světlo  Vlhkost  Složení plynné fáze  Složení médií  Aseptická kultivace  Ošetření mateřských rostlin  Typ explantátu Koncentrace plynů v pletivu závisí na : koncentraci v kultivační místnosti průniku do kultivační nádoby difúzi do kultivovaných buněk produkci/spotřebě plynu kulturou CO2, O2, etylén

SLOŽENÍ PLYNNÉ FÁZE Koncentrace plynů v pletivu závisí na : koncentraci v kultivační místnosti průniku do kultivační nádoby difúzi do kultivovaných buněk produkci/spotřebě plynu kulturou CO2, O2, etylén nefotosyntetizující pletiva --- respirace  CO2 CO2

SLOŽENÍ PLYNNÉ FÁZE Koncentrace plynů v pletivu závisí na : koncentraci v kultivační místnosti průniku do kultivační nádoby difúzi do kultivovaných buněk produkci/spotřebě plynu kulturou CO2, O2, etylén nefotosyntetizující pletiva --- respirace  CO2 CO2 fotosyntetizující pletiva --- fotosyntéza + respirace  fluktuace konc. CO2 fáze temnostní světelná Koncentrace CO2 Vyšší ozářenost  rychlé vyčerpání CO2 na světle

SLOŽENÍ PLYNNÉ FÁZE CO2 Koncentrace plynů v pletivu závisí na : koncentraci v kultivační místnosti průniku do kultivační nádoby difúzi do kultivovaných buněk produkci/spotřebě plynu kulturou CO2, O2, etylén nefotosyntetizující pletiva --- respirace  CO2 fotosyntetizující pletiva --- fotosyntéza + respirace  fluktuace konc. CO2 CO2 světelná Koncentrace CO2 temnostní Nízká ozářenost  nízká rychlost fotosyntézy  CO2 se může hromadit Vysoké konc. CO2 mohou způsobit např. trpasličí vzrůst nebo albinismus

Př:  O2  podpora pylové embryogeneze u tabáku PLYNNÁ FÁZE O2 konc. ovlivněna zejména respirací nižší v blízkosti explantátu než v okolí špatná aerace při kultivaci v tekutých médiích (konc. rozp. O2  s  °C; poměr objem/povrch)  dostupnosti O2  zvýšení respirace  podpora růstu  dostupnosti  omezení fotorespirace  dostupnosti  ovlivnění organogenní odpovědi explantátu Př:  O2  vývoj somatických embryí v suspenzní kultuře mrkve bez auxinu Př:  O2  podpora pylové embryogeneze u tabáku Př: Stimulace: produkce cibulek, prorůstání úžlabních pupenů dřevin Př: Inhibice: tvorba hlízek, růst a prodlužování výhonů Závisí na množství produkovaném kulturou Rychlosti odvodu z kultivační nádoby Etylén Může děje stimulovat inhibovat (závislost na koncentraci a fázi procesu)