Posttranslační modifikace proteinů v regulaci BC

Posttranslační modifikace jsou běžnou záležitostí Fosforylace transkripčních faktorů (viz jaderná lokalizace Swi5 z minula) Fosforylace CDK samotných Ale fosforylací možnosti nekončí... vazba dalších podjednotek, ubikvitinace, degradace...

Fosforylace proteinů obecně - rekapitulace N C O H C H R N C O H C H R O C CH 2 CH 3 OH CH OH S, Ser T, Thr Y, Tyr O P O- O CH 3 CH CH 3 A, Ala V, Val F, Phe CH 2 C O O- Q, Glu H, His

wee mutanti S. pombe wt cdc2-w wee1: tyrosin kináza cdc25: fosfatáza, opačný fenotyp! (P. Nurse et al.) (... mik1!) dvojitý mutant wee1 cdc25??

cdc13 (G2 cyklin) Substrátem Wee1 a Cdc25 je CDK! cdc2 Y15 - P cdc13 (G2 cyklin) cdc2 Y15 cdc25 wee1/mik1 nim1

CDC25 obvod je evolučně starý (aspoň u opisthokont) Aspergillus: NimT (Nim/Bim terminologie...) S. cerevisiae má... ale fenotyp?? –na první pohled nic –ALE víc dvojjaderných buněk – kontrola kvality (pučení) HeLa: Y15F – předčas. vstup do mitosy!! Xenopus: Y15 P ace nutná pro blok mitosy po aphidicolinu Rostliny???

(Simpson and Roger, Curr. Biol. 14:R693, 2005)

Exprese kvasinkového Cdc25 v rost. buňkách má fenotyp (Orchard et al.... Suchomelová, Lipavská )

CDC25, Ostreococcus Score E Sequences producing significant alignments: (bits) Value gb|AAQ | dual specificity phosphatase Cdc25 [Ostreoco gb|AAH | Cdc25b protein [Mus musculus] 112 2e-23 ref|NP_ | cell division cycle 25 homolog B [Mus musc e-23 gb|AAH | Cdc25b protein [Mus musculus] >gi| |d e-23 ref|XP_ | hypothetical protein [Neurospora crassa] > e-23 ref|NP_ | cell division cycle 25A [Rattus norvegicus e-22 ref|NP_ | cell division cycle 25B [Rattus norvegicus e-22 gb|AAR | cell division cycle 25B [Homo sapiens] >gi| e-22 gb|AAB | p63 [Homo sapiens] 109 1e-22 ref|NP_ | cell division cycle 25B isoform 2 [Homo sa e-22 ref|NP_ | cell division cycle 25B isoform 1 [Homo sa e-22 gb|AAH | CDC25B protein [Homo sapiens] >gi| |r e-22 ref|NP_ | cell division cycle 25B isoform 5 [Homo sa e-22 gb|AAP | Homo sapiens cell division cycle 25B [synthe e-22 emb|CAE | hypothetical protein [Homo sapiens] 109 1e-22 pdb|1CWR|A Chain A, Human Cdc25b Catalytic Domain Without I e-22 dbj|BAB | hypothetical protein [Macaca fascicularis] 109 1e ref|XP_ | unnamed protein product [Debaryomyces hans e-18 ref|XP_ | unnamed protein product [Candida glabrata] e-17 emb|CAA | NIMT/CDC25 [Emericella nidulans] >gi| e-17

„CDC25“, Arabidopsis Score E Sequences producing significant alignments: (bits) Value pdb|1T3K|A Chain A, Nmr Structure Of A Cdc25-Like Dual-Spec e-73 gb|AAO | At5g03455 [Arabidopsis thaliana] >gi| e-72 emb|CAB | putative protein [Arabidopsis thaliana] >gi e-72 gb|AAM | unknown [Arabidopsis thaliana] 268 3e-71 ref|NP_ | Hypothetical protein [Oryza sativa (japoni e-43 gb|AAU | rhodanese-like protein [Holcus lanatus] 170 8e-42 ref|NP_ | unknown protein [Oryza sativa (japonica cu e-41 gb|EAA | hypothetical protein FG [Gibberella z e-11 gb|EAA | hypothetical protein MG [Magnaporthe e-11 ref|XP_ | hypothetical protein [Yarrowia lipolytica] e-10 gb|EAA | hypothetical protein AN [Aspergillus n e-10 ref|XP_ | predicted protein [Neurospora crassa] >gi| e-09 ref|XP_ | unnamed protein product [Debaryomyces hans e-07 gb|EAL | hypothetical protein CNBB1040 [Cryptococcus e-06 gb|EAK | possible protein phosphatase [Candida albica e-06 ref|NP_ | rhodanase domain protein [Schizosaccharomy e-06 ref|NP_ | hypothetical protein RB11227 [Rhodopirellu e-04 gb|EAA | GLP_574_157368_ [Giardia lamblia ATCC e-04 ref|YP_ | putative sulfurtransferase [Thermus thermo e-04 ref|ZP_ | COG0607: Rhodanese-related sulfurtransfe e-04 sp|P27477|THTR_SYNP7 Putative thiosulfate sulfurtransferase gb|EAK | hypothetical protein UM [Ustilago may gb|AAP | Hydroxyacylglutathione hydrolase [Bacillus c ref|NP_ | Arr2p [Saccharomyces cerevisiae] >gi| ref|YP_ | putative sulfurtransferase [Thermus thermo ref|XP_ | unnamed protein product [Candida glabrata] emb|CAA | NIMT/CDC25 [Emericella nidulans] >gi| Landrieu et al (chybí regulační doména?)

A to ještě není všechno: CDK mají i další fosforylační místa. T14 Y15 T161 Y15 T14 T161 Y15 T14 Y15 T161 T14 Y15 T161 cdc25 wee1 cyklin

CAKs – CDK activating kinases Kvasinky: S. pombe: –Mcs6/Mcs2 (CDK/cyklin) je CAK i CTD kin. –upstream CAKAK (monomerní) S. cerevisiae: –monomerní CAK (Cak1p) –monomerní CTD kin (Kin28p)

A co rostliny? Arabidopsis: –CAK1-CAK4 –CAK2, CAK4 blízké CDK7 –substrátem CTD i CDK –CAK1 (CDKF): upstream od CAK2,4 (CAKAK!), komplementuje cak1 ts Shimotohno et al. (incl. K. Bišová) 2004

CAK mezi rost. CDK Robbens et al. 2004

(Doerner lab 2005) exocytosis via NSF (PCTAIRE! – Liu et al. 2006)... a u živočichů

Rozdíly jsou v délce kinázové kaskády? CDK CAK CAKAK S. pombe, metazoa, rostliny S. cerevisiae CTD inaktivní aktivní kináza substrát

Degradace proteinů jakožto „extrémní modifikace“

Zpět k cyklovým hodinám kvasinek

Rekapitulace: transkripční regulační obvody pučivé kvasinky Amon et al Co brání současné aktivaci CLB a CLN? Swi4, Swi6 Mbp1, Swi6

Mutanti S.c. s dlouhými pupeny a G1 jádrem cdc4, cdc34, cdc53

... a také všeobecný nedostatek CLB! (Schwob et al. 1994) (drženo na živu GAL:CLB5)

Clb/Cdc28 potřebuje k aktivaci ještě něco...

... co chybí v „dlouhopupenatých“ mutantech. (pozor na kontroly!!)

p40 SIC1 : inhibitor CDK nalezen biochemicky esenciální ale dvojitý mutant cdc34 sic1 replikuje v pm- je cdc34, cdc4, cdc53 třeba pro degradaci?? ANO! inhibitory CDK degradace

Model

Jorgensen and Tyers 2000 Sic1 sám je regulován i transkripčně

CycD CLB Inhibitory CDK (CKI): Cdc28 CDK4 CycA etc. CDK2/4 p40 Sic1 p15 p21, p27 Kip1

CKI a vstup do cyklu (živ. b.) G0/G1 S pRB CycD/CDK4 CycE/CDK2 p15 p16 p21 p27 p53

CDK inhibitory jakožto antionkogeny

Co jsou Cdc4, Cdc34, Cdc53?? Degradace proteinů zprostředkovaná ubikvitinací

Ubiquitin 76 aa, 8.5 kDa 96 % ident. člověk-kvasinka

CDC34 = E2!!!

E3 – ubikvitin ligázy: SCF (Skp1/cullin/F-box) Cul1 = cullin = Cdc53!! Sic1 Cdc34 Cdc4 NEDD8= Rub1 (related to ubiquitin)

Jiné tváře SCF Cul1 = cullin = Cdc53!!, CUL1 Sic1 Cdc34 Cdc4 TIR1 auxin response fotomorfogeneze Neddylace: AXR1 deNeddylace: COP9 signalosom

... degradace cyklinů...

Úloha CDK-cyklinových komplexů: co je třeba pro vstup do mitosy (G2/M)? Aktivace CDK vazbou „mitotických cyklinů“ (CLB, CycA/B), tedy degradace CKI a cyklinů předchozí vlny? Aktivace CDK fosforylací T161 Dereprese CDK defosforylací T14, Y15 Ještě něco??

Jakou roli hraje degradace mitotických cyklinů? Nedegradovatelný cyklin A,B Nadprodukce „destruction boxu“ Metaphase arrest!! Je destrukce cyklinu nutná pro přechod Meta/Ana? RxxLxxxxN cyclin „destruction box“

cyclin CDK metafáze anafáze telofáze G1 CDK

ALE: cdc15! Anafáze při vysoké hladině CLB/CDK!! (Surana et al. 1993) lND fenotyp

... a nadbytek CLB blokuje v anafázi, ne metafázi! (Surana et al. 1993)

cyclin CDK metafáze anafáze telofáze G1 CDK Cdc15... ALE předcházející pokusy s M blokem po inhibici degradace cyklinů!

Jak smířit modely? cyclin CDK metafáze anafáze telofáze G1 CDK Cdc15 X... a co tedy degraduje ty cykliny??

CLB se nehromadí v buňkách bez CLN (Amon et al. 1994)

... a příčinou je specifická degradace!

... a navíc: Obnova CLN kinázy stabilizuje CLB. Model!

Mají „cyklové hodiny“ trojtaktní motor? (CKI) CLN CLB none