Ubikvitinový systém pro degradaci proteinů a některé z jeho funkcí při kontrole BC 1937 Karcag, Maďarsko 1950 Izrael Faculty of Medicine at the Technion in Haifa 2004 Nobelova cena za chemii AVRAM HERSHKO

University of California, San Francisco Mechanismus indukce syntésy tyrosin-aminotransferasy (TAT) vlivem steroidních hormonů v kultivovaných jaterních buňkách Degradace TAT (1969-71) Gordon Tomkins 1939 izotopové značení 15N-Leucin Méně než 1/3 izotopů nalezeno v moči => většina zabudována do proteinů tkání Stálá váha zvířat – dynamická výměna proteinů Degradace abnormálních a poškozených proteinů Rudolf Schönheimer (BRD, 1898-1941)

První pokus Výměna média – rychlý pokles Poločas rozpadu 2-3h Degradace zastavena inhibitory tvorby energie v buňce (KF a další) Potvrzovalo studii Simpsona o spotřebě En. při uvolňování AMK z proteinů v játrech Nepřímý důkaz, En. nutná pro udržení kyselého pH v lysozomu Pohlcení lysozomem ne, degradace TAT vyžaduje specifický enzym Spotřeba ATP ( neobvyklý proces – existence intracelulárního proteolytického systému)

Proteolytický systém z lyzovaných retikulocytů závislý na ATP Hledání příčin potřeby energie v Izraeli Využití klasické biochemie Reakce buněčných lyzátů ve zkumavkách věrohodně reprodukující procesy Frakcionace a oddělování komponent Čištění a charakterizace komponent Rekonstrukce systému z izolovaných přečištěných jednotek Joseph Etlinger Proteolytický systém z lyzovaných retikulocytů závislý na ATP (1977) Alfred Goldberg Proerytroblast → Basofilní erytroblast → Polychromatofilní erytroblast → Ortochromatický erytroblast → Retikulocyt → Erytrocyt

Identita APF-1 a ubikvitinu potvrzena 1980 Wilkinsnem Izolace a charakterizace komponent ATP-dependent proteolytic system from reticulocyt lysates Irvin Rose Rozdělení lyzátu do 2 frakcí na diethylaminoethyl (DEAE-) celulóze Frakce 1 obsahuje látky neadsorbované - hemoglobin (vyčištění) Frakce 2 uvolněná solným roztokem, obsahuje nehemoglobinové proteiny Samostatně frakce nejevily aktivitu, opětovnou kombinací počala ATP-dependentní degradace Aktivní složka ve frakci 1 byla malá, teplotně stabilní molekula Pojmenovaná APF-1 (ATP-dependent Proteolysis Factor 1) Identita APF-1 a ubikvitinu potvrzena 1980 Wilkinsnem Aaron Ciechanover

Ubikvitin – funkce a vazba První izolace Goldsteinem při zkoumání hormonů brzlíku Postupně objeven ve všech tkáních a všech eurkaryotických organismech (ubiqity = všudypřítomný) Funkce neznámá Malá molekula z frakce 1 = domněnka regulační podjednotky neznámého enzymu z frakce 2 Radioaktivně označený ubikvitin byl přidán k frakci 2 za přítomnosti i nepřítomnosti ATP Gelovou chromatografií bylo zjištěno spojení s velkou vysokomolekulární látkou Navázán kovalentní peptidovou vazbou Ubikvitin se váže na velké množství proteinů (SDS-page)

Ubikvitin označený 125I byl inkubován s neoznačenými lysozomy a naopak a po rozdělení Ubikvitin se váže na substrát, který má být rozložen ATP-dependentním proteolitickým systémem (např. lysozomem)

Původní předpoklad

Jak je ubikvitin navázán na proteiny? 10 let práce, podstata návrhu správně Sled 3 enzymů – E1: ubikvitin aktivující – E2: přepravce ubivitinu – E3: ubikvitin ligasa

Funkce enzymů E1 zajistí aktivaci karboxylového konce glycinového zbytku ubikvitinu pomocí ATP a následuje připojení aktivovaného ubikvitinu do thiolového vazebného místa enzymu E1 thioleserovou vazbou Transacylací je aktivovaný ubikvitin přesunut do SH místa enzymu E2, který přenese ubikvitin až k – NH2 skupině cílového proteinu Navázání na protein probíhá pomocí enzymu E3, který je substrátově specifický Velký počet E3 enzymů

Proteiny s navázanými řetězci ubikvitinů jsou rozloženy v proteozomovém komplexu (26S) Ubikvitin je uvolněn ubikvitin-C-terminální hydrolasou nebo isopeptidasou http://plantsubq.genomics.purdue.edu/plantsubq/images/26S_Proteasome.png

Mechanismus degradace cyklinu B a objeveni APC/C komplexu 1990 Jak je degradace specifických buněčných proteinů obstarávána ubikvitinovým systémem v selektivních a regulovaných dějích? Cyklin B - Pozitivně regulující jednotka Cdc2 (Cdk1) - Komplex Cdk1-cyklin B = MPF, podporuje vstup do mitosy - Inaktivace MPF = degradace cyklinu B, nutné pro opuštění mitosy Jaký je systém degradace cyklinu B a proč pouze na konci mitosy?

Spisula solidissima (Surf clam) Produkce velkého počtu oocytů Luca a Ruderman vytvořili bezbuněčný systém z oplozených oocytů, který reprodukoval specifická stádia BC degradace mitotických cyklinů Pomoc Roberta Palazza, Leonarda Cohen, Joan Ruderman. Joan Ruderman (USA) Frakcionace systému prokázala výskyt dvou komponent důležitých pro navázání ubikvitinu k cyklinu B (E2-C, E3-like activity) E3-like activity: 1500 kDa komplex, který váže ubikvitin na mitotické cykliny, oscilující v BC, inaktivní v interfázi a aktivní na konci mitosy. K aktivitě potřebuje přítomnost MPF (Cdk1-cyclin B).

Název ubikvitnové ligasy cyklosom Podobná zjištění: Kirschner team – Xenopus eggs Anaphase-Promoting Complex Nasmyth team – Yeast Anphase-Promoting Complex / cyclosome = APC/C Degradace mnoha regulátorů BC (securin – inhibitor počátku anafáze) Kontrolní bod dělícího vřeténka (dovoluje rozchod chromatid pouze po řádném připojení na vřeténko)

Degradace Cdk inhibitoru p27Kip1 p27 způsobuje zastavení buňky v G1-fázi, zabraňuje vstupu do S (inhibuje Cdk2-cyklin A a Cdk2-cyklin E) p27Kip1 univerzální inhibitor pro všechny cyklin-Cdk komplexy Prokázána degradace p27 ubikvitinovým systémem Michele Pagano Pokusy pro identifikaci ubikvitin-ligasového systému označujícího p27 k degradaci, in vitro na HeLa buňkách p27 se vázal na uvikvitin v extraktu rostoucích buněk více než v buňkách „uzamčených“ v G1 Prokázána nutnost fosforylace p27 na T187, komplexem Cdk2-cyklin E pro ligaci p27-ubikvitin in vitro => kompetentní systém in vitro se stejnými pochody jako in vivo Identifikace enzymu E3 – ubikvitinové ligasy Přepoklad nutné přítomnosti SCF (Skp1-Cullin1-F-box protein) kvůli fosforylaci p27 substrátu

SCF komplexy velká rodina ubikvitin-protein ligáz variabilní F-box podjednotka rozpoznává příslušný fosforylovaný proteinový substrát Objev Skp2 proteinu (S-phase kinase-associated protein 2) = specifický F-boxu pro SCF, který připojuje ubikvitin k p27

Navázání ubikvitinu na p27 Vyvázání Skp2 protilátkou z extraktu proliferujících buněk = zrušení vazné aktivity p27-ubikvitin Dodaná rekombinantní vyčištěná Skp2 kompletně obnovila navázání ubikvitinu na p27 In vitro důkaz: vazba p27 na Skp2 závisí na fosforylaci p27 na T187 (In vivo popsal Pagano lab) => Skp2 je specifický a limitující faktor SCF komplexu, který předurčuje p27 k degradaci Oscilace Skp2 v BC: v G1 velmi nízký, roste před vstupem do S a dále jen klesá

Pokus o sestavení komlexu z jednotlivých komponent (Cullin, Skp1,Skp2, Roc1, Cdk/cyclin E, E1 a E2) Chyběla Cks1 (cyklin kinase subjunit 1) Patří do konzervativní rodiny proteinů Suc1/Cks, jako jediný z rodiny váže Cdk k fosforylovanému proteinu Pro regulaci BC nezbytná

Rodina Suc1/Cks a Cks1 Pouze Cks1 podmiňuje vazbu p27-ubikvitin v uměle poskládaném systému přečištěných komponent Ostatní Suc1/Cks proteiny mají vazebná místa pro Cdk a aniontové vazebné místo Cks1 se dokáže navázat na Skp2 a podporuje spojení Skp2 s fosforylovaným p27 na T187 Cks1 má tři vazebná místa, všechna nutná k asociaci Skp2 na T187-fosforylovaný p27

Apeluje na propojení genetiky s biochemií!