Poruchy krvetvorby a krve Seminář Karel Šulc, Pavel Klener Ústav patologické fyziologie 1. LF UK

Figure 1. Scanning electron microscopy of a normal red blood cell Schrier, S. ASH Image Bank 2003;2003:100647 Copyright ©2003 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Schrier, S. ASH Image Bank 2003;2003:100647 Figure 2. Reticulocyte stain identifies young red blood cells (RBC) that have just left the marrow Schrier, S. ASH Image Bank 2003;2003:100647 Copyright ©2003 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Maslak, P. ASH Image Bank 2005;2005:101325 Figure 1. Nucleated red blood cells may be seen in the peripheral blood as part of a reactive process Maslak, P. ASH Image Bank 2005;2005:101325 Copyright ©2005 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Maslak, P. ASH Image Bank 2003;2003:100720 Figure 2. Dohle body Maslak, P. ASH Image Bank 2003;2003:100720 Copyright ©2003 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Maslak, P. ASH Image Bank 2003;2003:100720 Figure 1. Peripheral smear from a patient with infection shows granulocytes with Dohle bodies Maslak, P. ASH Image Bank 2003;2003:100720 Copyright ©2003 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Maslak, P. ASH Image Bank 2005;2005:101401 Figure 1. Scanning under low power reveals a heterogenous population of cells Maslak, P. ASH Image Bank 2005;2005:101401 Copyright ©2005 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Figure 1. High power view of normal bone marrow Maslak, P. ASH Image Bank 2002;2002:100426 Copyright ©2002 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Figure 2. Heterogeneous population of cells in a normal bone marrow Maslak, P. ASH Image Bank 2002;2002:100426 Copyright ©2002 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Figure 1. Cluster of promyelocytes in various stages of maturation Maslak, P. ASH Image Bank 2005;2005:101357 Copyright ©2005 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Maslak, P. ASH Image Bank 2005;2005:101356 Figure 1. The nuclear cytoplasmic ratio is decreased compared to the myeloblast Maslak, P. ASH Image Bank 2005;2005:101356 Copyright ©2005 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Maslak, P. ASH Image Bank 2004;2004:101156 Figure 1. The specific granules of the eosinophil are larger and stain more intensely than those seen in the neutrophil Maslak, P. ASH Image Bank 2004;2004:101156 Copyright ©2004 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Maslak, P. ASH Image Bank 2004;2004:101228 Figure 1. Platelets can be seen as individual structures forming on the periphery of this megakaryocyte Maslak, P. ASH Image Bank 2004;2004:101228 Copyright ©2004 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Maslak, P. ASH Image Bank 2004;2004:101228 Figure 2. A very granular cytoplasm can be appreciated in this megakaryocyte Maslak, P. ASH Image Bank 2004;2004:101228 Copyright ©2004 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Lazarchick, J. ASH Image Bank 2004;2004:101190 Figure 2. At a higher magnification, the darker-staining small mantle cell lymphocytes surround the paler-staining follicular center cells Lazarchick, J. ASH Image Bank 2004;2004:101190 Copyright ©2004 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Lazarchick, J. ASH Image Bank 2004;2004:101190 Figure 3. The follicular center cells are larger than the surrounding mantle cells Lazarchick, J. ASH Image Bank 2004;2004:101190 Copyright ©2004 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Lazarchick, J. ASH Image Bank 2004;2004:101190 Figure 5. Immunohistochemical staining with anti-CD 20 highlights the B-cell lymphocytes of the germinal center (mantle zone and follicular center) Lazarchick, J. ASH Image Bank 2004;2004:101190 Copyright ©2004 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Lazarchick, J. ASH Image Bank 2004;2004:101190 Figure 6. The CD 20 staining cells of the mantle zone and follicular center are better defined in this higher magnification of the previous image Lazarchick, J. ASH Image Bank 2004;2004:101190 Copyright ©2004 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Lazarchick, J. ASH Image Bank 2004;2004:101190 Figure 7. Immunohistochemical staining with anti-CD5 highlights the B cells of the mantle zone (dark staining cells) Lazarchick, J. ASH Image Bank 2004;2004:101190 Copyright ©2004 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Figure 2. The iron is contained within cells of the RES system Maslak, P. ASH Image Bank 2004;2004:101141 Copyright ©2004 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Maslak, P. ASH Image Bank 2004;2004:101123 Figure 1. Several erythroid precursors cluster around a central "nursing" histiocyte Maslak, P. ASH Image Bank 2004;2004:101123 Copyright ©2004 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Maslak, P. ASH Image Bank 2003;2003:100723 Figure 1. Osteoblasts form a cluster of cells with granular basophilic cytoplasm Maslak, P. ASH Image Bank 2003;2003:100723 Copyright ©2003 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Maslak, P. ASH Image Bank 2005;2005:101358 Figure 1. Osteoclasts have multiple nuclei which are separated by cytoplasm Maslak, P. ASH Image Bank 2005;2005:101358 Copyright ©2005 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Hemoglobin Určení v objemové jednotce krve, tj. v erytrocytech i v plazmě. Normální hodnoty ženy: 125 – 155 g / 1 litr 12,5 – 15,5 g / 100 ml muži: 135 – 175 g / 1 litr 13,5 – 17,5 g / 100 ml Zvýšení: polycytémie, dehydratace Snížení: anemie, hyperhydratace

Počet erytrocytů udáván v množství x 1012/ 1 litr nebo x 109/ 1 ml nebo x 106 / 1 μl Normální hodnoty ženy: 3,8 – 5,2 x 1012 / 1 litr muži: 4,2 – 5,8 x 1012 / 1 litr Snížení: anemie, expanze ECT Zvýšení: polycytémie, dehydratace

Hematokrit HTK udává procentuelní zastoupení formovaných krev- ních elementů v objemové jednotce krve Normální hodnoty ženy: 0,35 – 0,46 35 - 46 % muži: 0,38 – 0,49 38 – 49 % po narození: až 0,60 pak pokles, na počátku puberty 0,39, na konci puberty návrat k normálním hodnotám Snížení: anemie, expanze ECT Zvýšení: polycytémie, dehydratace

MCV – střední objem erytrocytu Normální hodnota = 87,5 fl (80-96fl) MCV je změněn u různých anomálií erytrocytů (srpkovitá anemie, poikilocytóza, anisocytóza a další). Je využíván k rozlišení normo-, mikro- a makrocytárních anemií Výpočet: hematokrit x 103 / počet ery ( x 1012/ 1 litr) Pozn.: téměř vždy je MCV určen analyzátorem

Změny velikosti a tvaru erytrocytů anizocytóza

Změny velikosti a tvaru erytrocytů poikilocytóza

Změny velikosti a tvaru erytrocytů sférocytóza

Změny velikosti a tvaru erytrocytů sideropenická anemie

Změny velikosti a tvaru erytrocytů makrocytární anemie

Změny velikosti a tvaru erytrocytů makrocytární anemie

Změny velikosti a tvaru erytrocytů Srpkovitá anemie

MCH - obsah hemoglobinu v 1 erytrocytu Norma: 29 pg (28-33pg), 18 fmol zvýšení: makrocytární anemie, snížení: mikrocytární anemie Výpočet: MCH=Hb (v g / 100 ml krve) / ery (x 1012 / 1 litr)

MCHC = střední koncentrace Hb v erytrocytech Norma = 34 +- 2 % zvýšení: hereditární sférocytóza norma až mírné snížení: makrocytární anemie snížení: mikrocytární anemie Výpočet: MCHC = Hb (v g /100 ml krve)x 100 / hematokrit

Počet retikulocytů je udáván v % všech buněk červené řady v krvi. Norma: ženy i muži 0,5 – 1,5 % při intravitálním barvení (brilantkresylová modř) je podíl RTC stanoven z nátěru stanovením průtokovou cytometrií jsou udány absolutní hodnoty Zvýšení: krvácení, hemolýza (kompenzační činnost dřeně) Snížení až vymizení: útlum erytropoézy, útlum dřeně

Vyšetření kostní dřeně Sternální punkce: z manubria sterni aspirace dřeňové krve umožňuje pouze provést cytologický rozbor (např. cytogenetika, FACS, molekulární biologie) Trepanobiopsie: ze spina iliaca superior posterior: umožňuje kromě aspirace dřeňové krve též získat vzorek kostní tkáně- nezbytné pro provedení histologického rozboru kostní tkáně http://portal.med.muni.cz/digitalni-video

Maslak, P. ASH Image Bank 2002;2002:100529 Figure 1. Bone marrow aspiration needles are smaller than the Jamshidi needles used to obtain bone marrow biopsies Maslak, P. ASH Image Bank 2002;2002:100529 Copyright ©2002 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Figure 1. Core biopsy obtained with a Jamshidi needle Maslak, P. ASH Image Bank 2002;2002:100432 Copyright ©2002 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Vyšetření kostní dřeně: hodnocení normo-, hypo-, hypercelularita, dysplazie kostní dřeně množství blastů, normálních a patologických sideroblastů rozlišení normálních a leukemických blastů (průkaz enzymatických aktivit, chromozomových změn, membrá- nových diferenciačních znaků, onkogenů a další)

Aplastická anemie hypocelularita dřeně a zmnožení tukových buněk.

Změna buněčnosti kostní dřeně Dysplazie

Stanovení erytropoetinu Určení: metodou ELISA nebo RIA v séru nebo v plazmě Snížená hladina (produkce): onemocnění ledvin, anemie z nedostatku erytropoetinu, karence proteinů, zvýšení paO2, polycythaemia vera Zvýšená hladina (produkce): sekundární polycytémie, snížení paO2, sideropenické a některé hemolytické anemie

Železo I. Volné železo je pro organismus toxické. V přítomnosti vol- ného Fe vznikají volné kyslíkové radikály. Pokud vznik volných radikálů přestane být řízen, vzniká oxidativní stres. Obsah železa v těle = 50 – 70 mmolů, tj. 3 – 4 g. Hemoglobin obsahuje 65 – 75 % Fe, myoglobin 3 – 5 %, enzymy s hemovou skupinou 0,2 %. V plazmě je 0,1 % vá- zaného na transferin, ve feritinu a hemosiderinu je 15 – 20 % železa.

Železo II. Resorpce: duodenum, horní část tenkého střeva. Denní resorpce: asi 18 μmolů Fe (1 mg), jsou tak uhrazeny denní ztráty. Výdej: není regulován. Resorpce závisí na 1) erytropoetické aktivitě kostní dřeně, 2) na stavu železa v zásobárnách Ztráty závisejí na obsahu feritinu v deskvamovaných buňkách. Jakmile je železo resorbováno, stane se součástí uzavřeného systému plazma – kostní dřeň – erytrocyty – zásobárny. Zásobní železo je uloženo ve formě feritinu a hemosiderinu

Stanovení Fe v séru Tranzitní pool Fe je stanovován jako sérové železo (veškeré železo je vázáno na transferin) a jako celková vazebná kapacita transferinu pro železo TIBC (total iron binding capacity). Podíl sérové železo / TIBC udává tzv. saturace transferinu. Norma: novorozenci 17,90 – 44,75 μmol / 1 litr děti 8,95 – 21,48 μmol / 1 litr ženy 7,16 – 26,85 μmol / 1 litr muži 8,95 – 28,64 μmol / 1 litr

TIBC (celková vazebná kapacita železa) Norma: 44,75 – 71,60 μmol / 1 litr Zvýšené hodnoty TIBC jsou při sníženém Fe v séru (více neobsazeného transferinu).

% saturace trasferinu (někdy se udává jako % saturace Fe) Výpočet: hladina sérového železa / TIBC Norma: 20 – 55 % Snížené hodnoty při deficitu Fe. Snížení saturace transferinu spolu s nízkými hodnotami TIBC: hemochromatóza, hemosideróza, onem. jater

Feritin v séru Hodnota slouží k posouzení stavu zásob železa v organismu. Norma: μg / 1 litr nebo ng / ml novorozenec 25 – 200 1. měsíc 200 – 600 6. měsíc – 15 let 7 – 140 ženy 12 – 150 muži 15 – 150 Snížení: lze detekovat již v počátečních stadiích sideropenické anemie Zvýšení: u anémií chronických chorob či nádorů

Sérový (solubilní) transferinový receptor (sTfR Hladina je stanovovována pomocí ELISA nebo firemních kitů. Zvýšení: deficit železa, intenzivní erytropoéza (hemolytické anemie, β-thalasemie, polycytémie) = zvýšená exprese TfR na buněčných membránách Snížení: útlum kostní dřeně, chronické selhání ledvin Pozn.: sTfR vzniká proteolýzou TfR na specifickém místě extracelulár- ní domény, vznikne monomer detekovatelný v plazmě nebo v séru. Mezi TfR a sTfR je konstantní vztah, sTfR je nepřímým ukazatelem exprese TfR v organismu.

Počet leukocytů Udává se v množství x 109 / 1 litr; x 106 / ml; x 103 / μl Leukocytóza Fyziologická: zvýšená tělesná námaha, gravidita, novoro- zenci Ostatní příčiny: akutní infekce, nekróza tkáně, krvácení, zvýšená produkce ACTH a glukokortikoidů (i po podání), leukemoidní reakce, stres, intoxikace Leukopenie odsun zejm. granulocytů do okrajové hotovosti, inefektivní granulopoéza, hypersplenismus, protilátky proti leukocytům, útlum kostní dřeně

Rozpočet bílých krvinek (diferenciální krevní obraz) Zjišťuje se zastoupení buněk bílé řady (PMNC i MNC) v nátěru. Granulocytóza - neutrofilní granulocyty Eozinofilie – zejm. u alergických stavů, při onemocnění pojiva („kolagenózy“), u kožních onemocnění (pemphigus vulgaris, dermatitis exfoliativa), u parazitárních onemocnění Eozinopenie – zvýšená produkce ACTH a glukokortikoidů, začátek těžkých infekcí Bazofilie – při CML, Hodgkinově nemoci, pravé polycyté- mii, diabetes, hypertyreóza Bazopenie – zvýšená produkce ACTH a glukokortikoidů

Vývojová stadia granulocytu

Leukemické blasty v kostní dřeni

Změny množství lymfocytů Lymfocytóza zejm. virové infekce infekční mononukleóza inf. cytomegalovirové ALL, CLL Lymfopenie zvýšení ACTH ozáření cytostatika lymfangiektazie v GIT drenáž dct. thoracicus (porušení stěny nádorem)

Lymfocyt

Lymfocyt Porovnání velikosti lymfocytu s velikostí erytrocytu

Stanovení některých enzymatických aktivit I. Alkalická fosfatáza (ALP) normální (nízká) aktivita - v normálních blastech a granulo- cytech zvýšená aktivita – stres, zvýšení glukokortikoidů, gravidita, polycythaemia vera snížená až nulová aktivita – CML, PNH, MDS

Stanovení některých enzymatických aktivit II. Kyselá fosfatáza nulová aktivita – normální blasty nízká aktivita – AML, CLL zvýšená aktivita – CML Peroxidázová aktivita nulové hodnoty – normální blasty zvýšené až vysoké hodnoty – MDS, AML

Stanovení některých enzymatických aktivit III. Aktivita nespecifických esteráz charakteristická pro monocyty (umožnění přesnější diagnostiky leukemií s monocytárními rysy) nulová aktivita = monocytoblasty

Průtoková cytometrie (flow cytometry) a FACS Průtoková cytometrie – technika umožňující kvantitativně i kvalitativně analyzo- vat částice – buňky – v suspenzi. Pomocí definovaných parametrů dovoluje cíleně separovat buňky na základě jejich fyzikálních a chemických vlastností (např. obsahu DNA, množství granul, pH ICT apod.) a po obsazení povrchu buněk mono- klonální protilátkou studium povrchových molekul diferenciačních antigenů, intra- celulárních molekul včetně cytokinů apod. FACS (Fluorescence-activated-cell-sorting) je jednou ze základních aplikací průto- kové cytometrie umožňující třídění buněčné suspenze do dvou i více frakcí. Třídění je založeno na odlišném rozptylu světla a fluorescenční charakteristice jednotlivé buňky v suspenzi. Užití v hematologii: Průtoková cytometrie umožňuje provádět analýzu vybrané buněčné populace např. určení membránových diferenciačních znaků, expresi leukocytárních markerů v průběhu hematopoetické diferenciace, imunofenotypizaci při myeloproliferativních onemocněních, analýzu DNA apod.

Průtoková cytometrie - FACS Rozdělení buněčných populací pomocí FACS

Některé membránové diferenciační znaky CD3 – T-lymfocyty, TCR (T-cell receptor) CD4 – pomocné T-lymfocyty CD7 – T-lymfocyty, NK buňky CD8 – cytotoxické/supresorové T-lymfocyty, NK buňky, thymocyty CD21, CD22 – prekursory a zralé B-lymfocyty CD34 – prekursory krvetvorných buněk CD50 – granulocyty CD52 – eozinofilní granulocyty CD61 – trombocyty, megakaryocyty CD70 – Reedové-Sternbergovy buňky, aktivované B- a T-lymfocyty CD77 – buňky Burkittova lymfomu, aktivované B-lymfocyty

http://www.hematology.org/ http://ashimagebank.hematologylibrary.org/

Reed-Sternberg cell