organizace genomu struktura a exprese genu mutace Kolektiv Laboratoře molekulární biologie Onkologické centrum J. G. Mendela Nový Jičín

FAKTA Nukleární DNA je lokalizována v jádře buněk Haploidní genom obsahuje 3x109 bp Počet předpokládaných genů 20.000 - 30.000 (50.000 – 100.000) Kódující sekvence 2 - 3 % Genetický kód je univerzální Geny jsou lokalizovány na chromosomech lineárně Geny mají exon/intronovou strukturu Diploidní lidský genom obsahuje 46 chromozomů (2x22 autosomů a 2 pohlavní chromozomy - X a Y) (žena 46 XX, muž 46 XY)

ZÁKLADNÍ POJMY Genom – veškerý genetický materiál jednotlivce Transkriptom – sada transkripovaných sekvencí Proteom – sada proteinů kódovaná genomem

GENOM Kódující sekvence: - cca 2 - 3% - „single genes“ - „repetetivní geny“ (pro rRNA, tRNA, histony) Intergenové oblasti Repetitivní sekvence: - tandemové - telomerické a subtelomerické - retropozóny (SINE, LINE) - MERs (medium and low reiteration frequency repeats) - endogenní retroviry a virální retrotranspozony Unikátní sekvence

GENOM

STRUKTURA GENU 5´ - - 3´ exon 1 exon 2 promotor UTR intron 1 UTR terminátor - 3´ místo „splicing“-u

GEN A JEHO STRUKTURA 5´- konec 3´- konec transkriptovaná oblast genu promotor ex 1 int 1 ex 2 int 2 ex 3 kódující sekvence mRNA 5´ UTR mRNA 3´ UTR začátek transkripce iniciační kodón pro syntézu proteinu terminační kodón pro ukončení syntézy proteinu (UGA, UAA, UAG signál pro poly(A)

GEN A JEHO STRUKTURA

GENOVÁ RODINA Konstantní exony 2 3 4 5

BUNEČNÍ CYKLUS REPLIKACE DNA buněčný cyklus semikonzervativní replikace „GAP1“ fáze - příprava na syntézu DNA M G1 G2 templát „syntetická“ fáze - syntéza (replikace) DNA S nově syntetizovaná DNA

REPLIKACE REPLIKON - úsek genomu, kde probíhá replikace. REPLIZÓM - proteinový komplex, s enzymatickou povahou, zajišťující replikaci úseku DNA. 3´ 5´ 3´ 5´

EXPRESE GENU – CENTRÁLNÍ DOGMA transkripce DNA translace RNA PROTEIN

EXPRESE GENU CENTRÁLNÍ DOGMA

EXPRESE GENU CIS/TRANS REGULACE

GENETICKÝ KÓD

MUTACE DĚDIČNÁ ZMĚNA GENOTYPU JAKÁKOLIV ZMĚNA V NUKLEOTIDOVÉ SEKVENCI NEBO V USPOŘÁDÁNÍ DNA EVOLUCE: MUTACE SELEKCE selekčně škodlivé selekčně neutrální selekčně výhodné

DĚLENÍ MUTACÍ podle vzniku - spontánní - indukované podle druhu buněk - gametické - somatické podle charakteru - genomové (numerické, chromosomové) - chromosomové (strukturální) - genové

TYPY MUTACÍ substituce - tranzice (PU-PU; PY-PY) - transverze (PU-PY; PY-PU) delece inzerce duplikace amplifikace repetitivních sekvencí

DELECE N 5´ - - - AGC TCC GGT AAC CCC GTA TTC - - - 3´ del 3 bp 5´ - - - AGC TCC AAC CCC GTA TTC - - - 3´ N 5´ - - - AGC TCC GGT AAC CCC GTA TTC GGG- - - 3´ del 1 bp 5´ - - - AGC TCC GGT AAC CCG TAT TCG GG - - - 3´

INZERCE N 5´ - - - AGC TCC GGT AAC CCC GTA TTC - - - 3´ ins 9 bp 5´ - - - AGC TCC AAC AAA AGC TTT CCC GTA TTC - - - 3´ ins 7 bp 5´ - - - AGC TCC AAC AAA AGC TCC CGT ATT C - - - 3´

SUBSTITUCE N 5´ - - - AGC TCC GGT AAC CCC GTA TTC - - - 3´ tranzice (PU-PU; PY-PY) M 5´ - - - AGC TCC GAT AAC CCC GTA TTC - - - 3´ transverze (PU-PY; PY-PU) M 5´ - - - AGC TCC GTT AAC CCC GTA TTC - - - 3´

CHROMOZOMÁLNÍ VS MOLEKULÁRNÍ ÚROVEŇ: TYPY MUTACÍ CHROMOZOMÁLNÍ VS MOLEKULÁRNÍ ÚROVEŇ: CITLIVOST METODY: SUBSTITUCE ANO NE DELECE ANO ANO/NE DUPLIKACE ANO ANO/NE INVERZE ANO ANO/NE INZERCE ANO ANO/NE TRANSLOKACE ANO ANO/NE MG CG

ÚČINEK MUTACÍ mutace měnící smysl kodonu (missense) Arg na Glu mutace beze smyslu (nonsense – vznik stop kodonu) mutace neměnící smysl kodonu (silent mutation) posunová mutace (frameshift) --ACG-GCT-AAA-TTC-- --ACA-AAT-TC-- 5. nestabilita (vedoucí k anticipaci)

FRAMESHIFT/ NON-FRAMESHIFT Delece: N 5´ - - - AGC TCC GGT AAC CCC GTA TTC - - - 3´ del 3 bp 5´ - - - AGC TCC AAC CCC GTA TTC - - - 3´ (non-frameshift) del 1 bp 5´ - - - AGC TCC GGT AAC CCG TAT TC - - - 3´ (frameshift) Inzerce: N 5´ - - - AGC TCC GGT AAC CCC GTA TTC - - - 3´ Ins 3 bp 5´ - - - AGC TCC GGT GCG AAC CCC GTA TTC - - - 3´ (non-frameshift) Ins 1 bp 5´ - - - AGC TCC GGT TTA ACC CCG TAT TC - - - 3´ (frameshift)

DELECE 5´ - - - AGC TCC GGT AAC CCC GTA TTC - - - 3´ 5´ - - - AGC TCC AAC CCC GTA TTC - - - 3´ 5´ - - - AGC TCC GGT AAC CCC GTA TTC GGG- - - 3´ 5´ - - - AGC TCC GGT AAC CCG TAT TCG GG - - - 3´ wt H2N ----- ser ser gly asn pro val phe ---- COOH del 3 bp (non-frameshift) H2N ----- ser ser asn pro val phe ---- COOH wt H2N ----- ser ser gly asn pro val phe gly---- COOH del 1 bp (frameshift) H2N ----- ser ser gly asn pro tyr ser ---- COOH

NONSENS MUTACE N DNA 3´ - - - AGC ATA GGT AAC CCC GTA ACC GGG - - - 5´ N mRNA 5´ - - - UCG UAT CCA UUG GGG CAU UGG CCC - - - 3´ N PROTEIN M DNA 3´ - - - AGC ATT GGT AAC CCC GTA ACC GGG - - - 5´ M mRNA 5´ - - - UCG UAA CCA UUG GGG CAU UGG CCC - - - 3´ M PROTEIN M DNA 3´ - - - AGC ATA GGT AAC CCC GTA ACT GGG - - - 5´ M mRNA 5´ - - - UCG UAT CCA UUG GGG CAU UGA CCC - - - 3´ H2N COOH (substituce A na T – vznik stop kodonu) H2N COOH zkrácený protein (substituce C na T – vznik stop kodonu) H2N COOH zkrácený protein

INZERCE N DNA 5´ - - - AGC TCC GGT AAC CCC GTA TTC - - - 3´ ins 9 bp 5´ - - - AGC TCC AAC AAA AGC TTT CCC GTA TTC - - - 3´ ins 7 bp 5´ - - - AGC TCC AAC AAA AGC TCC CGT ATT C - - - 3´ N PROTEIN H2N COOH M PROTEIN H2N COOH M PROTEIN H2N COOH

REKOMBINACE