IMUNOCHEMIE

CÍLE LABORATORNÍ DIAGNOSTIKY Vyhledávání nových případů onemocnění Potvrzení diagnózy Monitorování nemocných

LABORATORNÍ DIAGNOSTICKÝ PROCES A. PREANALYTICKÁ ČÁST: Nezbytná pro správné provedení laboratorního vyšetření Zahrnuje: Přípravu nemocného, podmínky odběru materiálu, skladování, transport a zpracování v laboratoři před vlastním testem

vlastní analytický proces prováděný v laboratoři B. ANALYTICKÁ ČÁST vlastní analytický proces prováděný v laboratoři Zahrnuje: Přípravu vzorku, měření, výpočet výsledků, validaci výsledků, vnitřní a vnější kontrolu kvality

Následuje po vlastním výkonu C. POSTANALYTICKÁ ČÁST Následuje po vlastním výkonu Zahrnuje: interpretaci výsledků ve vztahu ke klinickému stavu pacienta, anamnéze konzultace s lékařem

IMUNOCHEMICKÁ REAKCE: specifická interakce mezi antigenem (Ag) a protilátkou (Ab) protilátka – jedinečné specifické činidlo cíleně reagující s jedinou složkou (antigenem) ve složité směsi

   ANTIGEN PROTILÁTKA (imunogenní molekula) cíl diagnostiky (průkaz Ag) - průkaz virové částice, bakterie nebo její části, autoantigenu, hormonu, nádorového markeru aj.  prostředek diagnostiky (reagencie, činidlo) - získá se imunizací zvířete cílovým Ag prostředek diagnostiky (reagencie, činidlo) - virová částice, bakterie nebo její část, alergen, autoantigen aj.  cíl diagnostiky (průkaz Ab) - stanovení specifické Ab odpovědi proti virům, bakteriím nebo jejich části, alergenům, autoantigenům (autoprotilátek) aj.

IMUNOCHEMICKÁ REAKCE: základní charakteristikou této reakce je její specifita vztah antigen-protilátka je ovlivněn podmínkami reakce a prostředím (pH, iontová síla, teplota), druhem antigenu aj. klasické „sérologické“ metody (precipitace, aglutinace, hemaglutinace a KFR) mají tradici zejména v mikrobiologii a hematologii imunochemické reakce se uplatňují také v biochemii, nukleární medicíně, hematologii, patologii aj.

AGLUTINACE: Ag je korpuskulární vizuální hodnocení v roztoku kvalitativní (ano/ne) kvantitativní (titrace) průkaz specifických protilátek v infekční sérologii

AGLUTINACE

Stanovení množství precipitátu: PRECIPITACE: Ag je solubilní v gelu, vizuální hodnocení v roztoku, přístrojové hodnocení Stanovení množství precipitátu: PŘÍMO: nefelometrie, turbidimetrie NEPŘÍMO (metody s následnou detekcí): pomocí reakce se sekundární protilátkou značenou: enzymem – enzymová imunoanalýza EIA izotopem - radioimunoanalýza RIA luminoforem – luminiscenční imunoanalýza LIA fluorochromem – fluorescenční imunoanalýza FIA

P R E C I P I T A C E

P R E C I P I T A Č N Í K Ř I V K A Množství antigenu

TURBIDIMETRIE, NEFELOMETRIE precipitace v roztoku – přímé měření množství precipitátu - zákal kvantitativní stanovení (kalibrační křivka) výsledky poskytují velmi rychle lze je plně automatizovat, vhodné pro velké série vzorků používají se pro stanovení proteinů v séru a likvoru (imunoglobuliny, CRP, prealbumin, transferin aj.)

JEDNODUCHÁ RADIÁLNÍ IMUNODIFÚZE (MANCINI) JRID, SRID precipitace v gelu gel – hydratovaný polysacharid antisérum rozptýleno v gelu antigen difunduje z jamky do gelu - vzniká precipitační prstenec obsah prstence odpovídá koncentraci Ag kvantitativní stanovení (kalibrační křivka) jednoduchá a levná technika dlouhé inkubace (výsledky za 48-72 hod.) nelze automatizovat, vhodná pro menší série vzorků (IgG1-4, IgD, vzácné složky komplementu C2, C5, C1q atd.)

RADIÁLNÍ IMUNODIFÚZE

PŘÍKLAD PRO POUŽITÍ IMUNOCHEMICKÝCH TECHNIK ANALÝZA IMUNOGLOBULINŮ Normální hodnoty u dospělých IgG 7 – 19 g/l IgA 0,8 - 4,8 g/l IgM 0,5 - 3 g/l IgD 0,01 - 0,2 g/l IgE 0 - 200 kUI/l

SNÍŽENÉ HLADINY IMUNOGLOBULINŮ ZVÝŠENÉ HLADINY IMUNOGLOBULINŮ Imunodeficitní stavy: agamaglobulinemie hypogamaglobulinemie ZVÝŠENÉ HLADINY IMUNOGLOBULINŮ hypergamaglobulinemie

HYPERGAMAGLOBULINÉMIE zvýšení hladiny imunoglobulinové frakce séra: polyklonální oligoklonální monoklonální Kryoglobulinémie Amyloidóza

POLYKLONÁLNÍ HYPERGAMAGLOBULINÉMIE (gamapatie) Zvýšení hladin dvou a více imunoglobulinových tříd - charakteristický elektroforetický obraz séra - výrazné široké zvýšení v gama oblasti jaterní onemocnění, zvláště virové a autoimunitní hepatitidy, cirhóza chronické zánětlivé procesy (např Crohnova choroba, ulcerózní kolitida aj.) imunopatologické stavy (autoimunita) - Sjogrenův syndrom, SLE, revmatoidní artritida systémové maligní procesy

OLIGOKLONÁLNÍ HYPERGAMAGLOBULINÉMIE (gamapatie) Výrazné odlišitelné zóny (proužky) v oblasti gamaglobulinů při elektroforéze Nejčastější výskyt: protilátky proti antigenům krevních skupin virové infekce - protilátky proti povrchovým antigenům konstantní stimulace vybranými antigeny - autoimunitní choroby, parazitózy onemocnění centrální nervové soustavy - lokální humorální syntéza imunoglobulinů v likvoru

MONOKLONÁLNÍ HYPERGAMAGLOBULINÉMIE (gamapatie) Přítomnost monoklonálního imunoglobulinu (paraproteinu, M-komponenty, M-gradientu) v séru Obsah této frakce je syntetizován jedním klonem myelomových buněk (maligně změněné zralé B-lymfocyty) M-komponenta je tvořena imunoglobulinem jednoho izotypu, stejného typu lehkého řetězce a stejné antigenní specifity Mnohočetný myelom, Waldenstrőmova makrogobulinémie, MGUS aj.

DIFERENCIACE B -LYMFOCYTŮ NORMÁLNÍ A ABNORMÁLNÍ DIFERENCIACE B -LYMFOCYTŮ PLAZMAT. BUŇKA Y ZRALÝ B-LYMFO Y NEZRALÝ B-LYMFO CD 38 Y POLY-KLONAL. Ab Y Y Ag PODNĚT, CD 19 PŘESKUPENÍ Y Y TdT Ig GENU Y Y Y BcR CD 19 MYELOMOVÁ BUŇKA TRANSFORMACE MALIGNÍ Y CD 38 CD 56 Y MONO- KLONAL. Ab (PARAPROTEIN) Y AKUMULACE GENOVÝCH PORUCH Y Y Y

TYPY MONOKLONÁLNÍCH GAMAPATIÍ MGUS monoklonální gamapatie nejasného významu nízké koncentrace paraproteinu dříve klasifikovány jako benigní paraproteinémie dlouhodobě (roky) se koncentrace paraproteinu významně nemění (nestoupá) žádný nález na skeletu Mnohočetný myelom (MM) maligní onemocnění plasmocytom lokalizován v kostní dřeni osteolytické léze vysoká koncentrace paraproteinu (i v moči)

TYPY MONOKLONÁLNÍCH GAMAPATIÍ Makroglobulinémie (Waldenstrőmova) lymfom infiltrující lymfoidní tkáně paraprotein v IgM třídě velmi vysoká koncentrace paraproteinu - ovlivňuje viskozitu séra Nemoc z lehkých řetězců Nemoc z těžkých řetězců

DIAGNOSTIKA MONOKLONÁLNÍCH GAMAPATIÍ SCREENING elektroforéza séra – detekce přítomnosti paraproteinu (M gradientu) – zóny s vysokou denzitou KVANTIFIKACE denzitometrické měření z elektroforézy relativní podíl paraproteinu z celkového elektroforetického obrazu v % měření celkového proteinu v séru výpočet koncentrace paraproteinu v g/l

podle náboje se rozdělí v elektrickém poli (albumin, , , - frakce ) A. SCREENING : ELEKTROFORÉZA proteiny mají el. Náboj podle náboje se rozdělí v elektrickém poli (albumin, , , - frakce ) orientační informace o změnách v kvantitativním zastoupení jednotlivých frakcí možnost denzitometrické kvantifikace

E L E K T R O F O R É Z A

ELEKTROFORÉZA VZORKŮ SÉRA - + LEGENDA: vzorek č. 3: susp. paraprotein vzorek č. 7, 8: susp. paraprotein ostatní vzorky: polyklonální imunoglobuliny (norm. nález)

B. TYPIZACE určení typu těžkého (α,γ,μ,ε,δ) a lehkého řetězce (κ,λ) starší metoda kombinace elektroforézy a imunodifúze paraprotein z elektroforeticky rozděleného séra difunduje v gelu proti poly- nebo monospecifickému antiséru a výsledek se hodnotí ze vzhledu precipitační zóny IMUNOELEKTROFORÉZA

I M U N O E L E K T R O F O R É Z A

IMUNOFIXACE moderní postup sérum je elektroforeticky rozděleno v gelu v několika drahách na povrch gelu je naneseno do každé dráhy jiné monospecifické antisérum (proti IgG, IgA, IgM, kappa, lambda) imunoglobuliny ze séra tvoří s monospecifickým antisérem imunokomplex (precipitát), který po odmytí nezreagovaných komponent je možno barvit a pozorovat imunofixace – citlivější a jednodušší metoda než imunoelektroforéza

I M U N O F I X A C E

IMUNOFIXACE VZORKU SÉRA ZDRAVÉ OSOBY - + IMUNOFIXACE VZORKU SÉRA ZDRAVÉ OSOBY LEGENDA: sloupec č. 1: elektroforéza séra další sloupce: imunochemický průkaz jednotlivých těžkých a lehkých řetězců imunoglobulinů, je zřetelná polyklonální produkce

SÉRA NEMOCNÉHO S PARAPROTEINEM IgM  - + IMUNOFIXACE VZORKU SÉRA NEMOCNÉHO S PARAPROTEINEM IgM  LEGENDA: sloupec č. 1: monoklonální pruh na pozici 6 sloupec č. 4 a 6: imunochemický důkaz přítomnosti paraproteinu IgM 

SÉRA NEMOCNÉHO S PARAPROTEINEM IgG  - + IMUNOFIXACE VZORKU SÉRA NEMOCNÉHO S PARAPROTEINEM IgG  LEGENDA: sloupec č. 1: monoklonální pruh na pozici 6 sloupec č. 2 a 6: imunochemický důkaz přítomnosti paraproteinu IgG  INTERPRETACE: susp. mnohočetný myelom IgG 

SÉRA NEMOCNÉHO S PARAPROTEINEM IgG  - + IMUNOFIXACE VZORKU SÉRA NEMOCNÉHO S PARAPROTEINEM IgG  LEGENDA: sloupec č. 1: monoklonální pruh na pozici 4 sloupec č. 2 a 6: imunochemický důkaz přítomnosti paraproteinu IgG  INTERPRETACE: paraprotein IgG 

IMUNOFIXACE VZORKU SÉRA NEMOCNÉHO S PARAPROTEINY IgG  a IgA  - + IMUNOFIXACE VZORKU SÉRA NEMOCNÉHO S PARAPROTEINY IgG  a IgA  LEGENDA: sloupec č. 1: monoklonální pruhy na pozici 4 a 6 sloupec č. 2 a 6: imunochemický důkaz přítomnosti paraproteinu IgG  sloupec č. 3 a 6: imunochemický důkaz přítomnosti paraproteinu IgA  INTERPRETACE: dva paraproteiny IgG , IgA  KOMENTÁŘ: přítomnost dvou klonů myelomových buněk

SÉRA NEMOCNÉHO S PARAPROTEINEM IgM  - + IMUNOFIXACE VZORKU SÉRA NEMOCNÉHO S PARAPROTEINEM IgM  LEGENDA: sloupec č. 1: monoklonální pruh na pozici 4 sloupec č. 4 a 5: imunochemický důkaz přítomnosti paraproteinu IgM INTERPRETACE: susp. Waldenströmova makroglobulinemie