Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie

Vyzkoušíte si přípravu preparátů Dozvíte se něco o: Speciální světelné mikroskopii Zástin a fázový kontrast Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) Hoffmanův modulační kontrast Fluorescenční mikroskopie Konfokální mikroskopie Vyzkoušíte si přípravu preparátů

Vzor protokolu Mikroskopická technika - Blok 2 Datum Mikroskopická technika - Blok 2 Úloha 1 – Autofluorescence plastidu Organismus Zvětšení Nativní preparát Krátký komentář…….. Protokoly budou obsahovat výsledky tří úloh, které si společně provedeme. Fotografie preparátů umístíme po praktiku na web a pošleme Vám odkaz. Obrázky vytisknete barevně nebo černobíle a dokreslíte pastelkami nebo fixy. Opatříte je popisky a krátkým komentářem. Foto Úloha 2 – Značení mitochondrie Organismus Zvětšení Nativní preparát Krátký komentář…….. Foto Úloha 3 – Imunofluorescence Organismus Zvětšení Trvalý preparát Krátký komentář…….. Foto Foto Foto Foto

Skládání a ohyb světla

Skládání a ohyb světla

Typy preparátů Amplitudové = zbarvené objekty absorbující světlo - rovnoměrně, jeví se jako tmavé - různě, jeví se jako barevné Fázové = nebarevné objekty, lišící se indexem lomu a tloušťkou Jejich kontrast lze zvýšit - barvením preparátů - optickými metodami

Preparát č. 2: Entamoeba invadens (fázový kontrast)

Koehlerovo osvětlení 1 (ideální nastavení světla v mikroskopu) 2 V dráze světelných paprsků v mikroskopu existuje několik rovin, které si jsou vzájemně zaostřené (skrze čočky) - konjugované. Pokud pozorujeme objekt v preparátu, tak k naší sítnici (1) je konjugovaná obrazová rovina objektivu (2), rovina preparátu (3). Aby byl preparát ideálně osvětlen, je potřeba, aby s těmito rovinami byla konjugovaná rovina povrchu zdroje světla (4). Nastavení se provádí posunem kondenzoru nahoru a dolů. Zároveň je potřeba světlo vycentrovat. Při takovém nastavení obraz neovlivňuje vlákno žárovky (nerovnoměrný zdroj světla), ale promítá se do něj povrch zdroje světla, ze kterého vychází rovnoměrné odvětlení. Preparát je tak rovnoměrně osvětlen. 3 Povrch zdroje světla 4

Nastavení Koehlerova osvětlení 1 2 2 1 3 http://www.youtube.com/watch?feature=player_detailpage&v=fNTNZ8nWPd4

Metody zvýšení kontrastu Zástin: clona zachycuje paprsky procházející přímo do objektivu, preparát je osvětlen z boku

Metody zvýšení kontrastu Fázový kontrast: rozdíly v posunu fáze světla, které neumíme vnímat, převádí na rozdíly v jeho intenzitě

Fázový kontrast

Preparát č. 2: Entamoeba invadens (fázový kontrast)

Preparát č. 1: Tritrichomonas foetus (fázový kontrast)

Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC): zobrazuje optický reliéf, který je u biologických objektů zpravidla shodný s reálným prostorovým reliéfem

Metody zvýšení kontrastu Hoffmanův modulační kontrast (HMC): podobný výsledek jako DIC, levnější, nevyžaduje polarizované světlo – proto jím lze pozorovat i objekty na dvojlomných podložkách (plastikové misky)

Preparát č. 4: Trypanoplasma borreli (DIC)

DIC (Nomarského kontrast)

Imunofluorescenční barvení Giardia intestinalis Odkápnout blokovací roztok a přidat 500 µl roztoku s protilátkami. Inkubovat ve vlhké komůrce 30’

Luminiscence Chemiluminiscence luciferáza – luciferin Excitace zářením: fosforescence fluorescence

Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl

Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl Přímá vazba fluorochromu DAPI, ethidiumBr, propidium jodid

Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl Přímá vazba fluorochromu DAPI, ethidiumBr, propidium jodid Nepřímá vazba fluorochromu pacific blue, alexa fluor 488, FITC, TRITC, alexa fluor 635

Imunofluorescence vazba sekundární protilátky s konjugovaným fluorochromem (FITC apod.) vazba primární protilátky s konjugovaným fluorochromem (FITC apod.) F F vazba primární protilátky F F F F

Imunofluorescence F F F F F F

Imunofluorescence HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA F F F F F F HA HA

Imunofluorescenční barvení Giardia intestinalis Odkápnout blokovací roztok a přidat 500 μl roztoku s protilátkami. Inkubovat ve vlhké komůrce 30’

Imunofluorescence HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA HA HA HA IscU (mitochondriální protein) α-tubulin

Fluorochromy GFP, RFP, YFP, CFP Vložení genu pro fluorochrom přímo do genomu GFP, RFP, YFP, CFP

Mitotracker

Mitotracker Naegleria gruberi Do kultury přidat 1 μl mitotrackeru. Inkubovat při pokojové teplotě 30’ i více.

Filtry: excitační a bariérový

Filtry: excitační a bariérový

Filtry: excitační a bariérový & dichroické zrcátko

Filtry: excitační a bariérový & dichroické zrcátko

Fluorescenční mikroskop

Co znamená „konfokální“?

Konfokální mikroskop Obraz je rekonstruován počítačem Zdrojem světla Je snímán jen obraz ze zaostřené roviny preparátu Zdrojem světla je laserový paprsek

Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie imunologie – lokalizace epitopů FITC, DAPI…

Imunolokalizace

Imunolokalizace

Imunolokalizace

FISH Fluorescence In Situ Hybridization

Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie Imunologie: lokalizace epitopů FITC, DAPI… Genomika: exprese a funkce genů GFP, RFP, YFP, CFP

Využití GFP

Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie Imunologie: lokalizace epitopů FITC, DAPI… Genomika: exprese a funkce genů GFP, RFP, YFP, CFP Proteomika: sledování pohybů a interakcí proteinů in situ PA-GFP, FRAP, FRET

Exkurze do laboratoře konfokální mikroskopie

Autofluorescence plastidů Zygnema sp. Euglena gracilis Kápneme na sklíčko a pozorujeme 1000x zvětšeno s immerzním olejem. Plastidy emitují červené světlo.

Mitotracker Naegleria gruberi Kápneme na sklíčko a pozorujeme 1000x zvětšeno s imerzním olejem. Mitotracker emituje červené světlo.

Imunofluorescenční barvení Giardia intestinalis HA HA HA IscU (mitochondriální protein) α-tubulin

Imunofluorescenční barvení Giardia intestinalis Odkápnout roztok s protilátkami Přidat 750 μl PBS Inkubovat 5’ Odkápnout a opakovat ještě 2x od bodu 2

Imunofluorescenční barvení Giardia intestinalis Odkápnout PBS a přidat 500 μl roztoku se sekundárními protilátkami. Inkubovat ve vlhké komůrce 30’

Imunofluorescence HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA F F F F F F HA HA IscU (mitochondriální protein) α-tubulin

Imunofluorescenční barvení Giardia intestinalis Odkápnout roztok s protilátkami Přidat 750 μl PBS Inkubovat 5’ Odkápnout a opakovat ještě 2x od bodu 2

Imunofluorescenční barvení Giardia intestinalis Montovat médiem Vectashield s DAPI (barví DNA modře) Zafixovat lakem na nehty Pozorovat 1000x zvětšeno s imerzním olejem.

Vzor protokolu Mikroskopická technika - Blok 2 Datum Mikroskopická technika - Blok 2 Úloha 1 – Autofluorescence plastidu Organismus Zvětšení Nativní preparát Krátký komentář…….. Protokoly budou obsahovat výsledky tří úloh, které si společně provedeme. Fotografie preparátů umístíme po praktiku na web a pošleme Vám odkaz. Obrázky vytisknete barevně nebo černobíle a dokreslíte pastelkami nebo fixy. Opatříte je popisky a krátkým komentářem. Foto Úloha 2 – Značení mitochondrie Organismus Zvětšení Nativní preparát Krátký komentář…….. Foto Úloha 3 – Imunofluorescence Organismus Zvětšení Trvalý preparát Krátký komentář…….. Foto Foto Foto Foto