Metody určování struktury látek Chiroptické metody Obsah přednášek Základní pojmy, varianty metod Teoretické základy cirkulárního dichroismu, specifika instrumentace CD Metodologie měření ECD a VCD, praktické poznámky, aplikace 4.-6. Aplikace chiroptických metod I a II, laboratoř ECD a VCD Chiroptické metody 2012

Vznik chiroptického signálu a funkce PEMu Modulace stavu polarizace Modulace intenzity faktor se získá kalibrací

Vznik chiroptického signálu a funkce PEMu Kalibrace pomocí pseudovzorku nabývajícího hodnoty v určitých bodech, jejich interpolací se získá kalibrační křivka: Kalibrace postihuje experimentální faktor daného přístroje (koef. g) PEM pracuje přesně na jedné vlnové délce, korigujeme dále účinnost vytváření přesného LCP a RCP záření je dáno vlnovou délkou,

3.1 Metodologie měření VCD Komerčně dostupné spektrometry VCD - založené na FTIR spektrometru Schéma optické a elektronické části FTIR spektrometru Intenzitní (amplitudová) modulace s fFT (DC) amplitud. modulace s fPEM (AC)+ amplitud. modulace s fFT (DC) FTIR spektrometr Chiroptické metody 2011

=IAC/IDC 2.3 Metodologie měření VCD Schéma optické a elektronické části FTIR spektrometru amplitud. modulace fPEM (AC)+ amplitud. modulace fFT (DC) =IAC/IDC Chiroptické metody 2011

Celkové schéma FTIR spektrometru Chiroptické metody 2011

Experimentální podmínky ve spektroskopii VCD Spektrální omezení materiál speciálních optických elementů (PEM) oborem citlivosti detektoru 900-1800 cm-1: MCT, chlazený kapalným dusíkem 4000-6000 cm-1: InGaAs, pokojová teplota 2000-4000 cm-1: MCT, termoelektricky chlazený, InSb chlazený kapalným dusíkem 5000-9000 cm-1: Ge, pokojová teplota nejdostupnější oblast 2000 – 800 cm-1 Dynamický rozsah A=0,1-1, optimální 0,4 - 0,6 Dosahuje se kombinací vhodné koncentrace vzorku, tloušťky kyvety a vhodným rozpouštědlem Typické koncentrace 0,05 – 1 mol l-1 typické objemy 50 – 100 ml typické hmotnosti 1 – 15 mg látky Typický velký počet akumulací počet intergerogramů 104, doba - hodiny

Experimentální podmínky ve spektroskopii VCD Rozpouštědla pro měření VCD ve střední IR oblasti a příslušná „spektrální okna“ Rozpouštědlo Spektrální okno / cm-1 CCl4 2000 – 850 DMSO-d6 2000 – 1100; 970 – 700 CS2 2000 – 1640; 1350 – 700 Methanol-d6 2000 – 1200 CHCl3 2000 – 1260; 1175 – 700 H2Oa 2000 – 1770; 1525 – 1000 CDCl3 2000 – 975 D2O 2000 – 1300; 1100 – 800a propanol 2000 – 1500 trifluorethanol a jen jestliže je použita kyveta o tloušťce < 6 mm a vyšší koncentrace Chiroptické metody 2011

D2O vs. H2O ve střední IR Here I show the detail in carbonyl region: The light blue is used for H2O, dark blue D2O and red color is used for the spectra of protein hemoglobin it H2O or D2O, , all with 15 mm pathlegth. The absorbance of about 2 in H2O is too high for VCD measurement in this region. In H2O we have to use very short pathleght a therefore very high concentration to see the signal of sample.

Korekce na nulovou linii ve spektroskopiích CD Příčiny odchylek od nulové linie zkreslující výsledné exper. spektrum: Dvojlom na optických materiálech čoček, filtrů, kyvet a dalších oken Odrazy od povrchů Vlastní absorpce vzorku v oblasti absorpčního pásu dochází k anomální disperzi velká absorpce způsobuje malou responzi detektoru, zvětšuje šum, zmenšuje S/N Tyto jevy spektrálně citlivé a způsobují falešné signály pozorované jako artifakty Stálý požadavek ověřování reality CD signálů Formulace a dodržování měřícího protokolu Celé série měření provádět za stejných podmínek (rozbitá kyveta – zkreslení výsledků) Chiroptické metody 2011

Ukázka reálné nulové linie (-)-isoschizogamine Ondřej Julínek, 2006 přednáška 2/

Korekce na nulovou linii ve spektroskopiích CD Kvalitní spektrum, jsou-li dostupné enantiomery R a S při stejné koncentraci, pro jejich ideální spektra platí experim. CD obou enantiomerů obsahují stejnou spektrální distorzi : úpravou dostaneme z experimentálních spekter „spektrum šumu“, noise, (distorze + šum) a korigované spektrum jednoho enantiomeru: Optimální základní linie – spektrum racemátu o stejné absorpci jako vzorek Nejsou-li dostupné oba enantioméry ani racemát, použijeme ke korekci spektrum rozpouštědla

3.2 Elektronový cirkulární dichroismus (ECD) lze sledovat ve viditelném oboru jen molekuly obsahující chromofory (barevné látky), nebo pak v UV oboru (UV chromofory) rozšířená technika využívaná v biochemii, nanotechnologiích (totologická chiralita), studium samoskladných systémů, chirálních ropoznávání

Schéma optické a elektronické části ECD spektrometru Xenonová lampa dvojitý hranolový monochromátor se současnou polarizační funkcí polarizace vyladěna soustavou křemenných destiček („Filter“) systém štěrbin PEM: napětí vložené na PEM je optimaliváno tak, aby vznikala čtvtvlnná destička pro všechna l (neděje se tak ve VCD) detektor je fotonásobič (photomultiplier, PM) elektronika – zpětná vazba „feedback“ zajišťující konstantní DC signál (neděje se tak ve FT VCD) zvyšování napětí na PM – úměrné absorbanci vzorku, měří se „absorpční spektrum“ lze měřit jen do určitého napětí na PM The porphyrins which we use include tetrapyridinium porphyrin and its cupper and iron derivatives. The first cupper derivative possesses no axial ligand, the iron derivative possesses the axial ligand. In addition we uses the tetra trimethylanilinium porphyrin having bulky mesosubstituents. As the DNA partner we used calf thymus natural DNA and synthetic sequential oligonucleotides composed from G-C pairs and A-T pairs. Porphyrins was followed in visible region via absorption in the Soret region, porphyrins alone do not show CD in this region, but as a complex with chiral matrix, induced CD in Soret region is observed. DNA alone exhibit characteristic UV absorption and particularly circular dichroism in this region. The base-pair C=O, C=N and in plane vibration are observed between 1800-1500 cm-1 in the infrared absorption and vibrational circular dichroism, the phosphate backbone can be observed around 1000 circular dichroism cm-1.

15

Metodologie měření ECD 165 -1100 nm, nejčastěji 180 - 700 nm disperzní spektrometry (scanning) obdobné jednopaprskovým absorpčním spektrofotometrům optimalizované na velkou světelnou propustnost (throughput) vybaveny polarizační optikou disperzní funkce kombinovaná s polarizací (Brewsterův úhel) Praktické poznámky nejdřív jednopaprskovou absorpci (podstatná je absorpce vzorek + rozpouštědlo), je-li A>2 => změna kombinace koncentrace, tloušťka kyvety, rozpouštědlo Veškeré světlo musí procházet vzorkem, žádné reflexe na stěnách, kapalinovém menisku apod., pozor na „zúžené“ kyvety, nutno použit clonu a testovat 16

Materiál kyvet s malým dvojlomem, izotropní Praktické poznámky Materiál kyvet s malým dvojlomem, izotropní nulová línie, „baselina“ se získá jako ECD rozpouštědla, naprosto stejné podmínky jako pro měření vzorku, vždy odečíst baselinu Měřit CD „kus“ před a za absorpčním pásem (20 nm), v oblasti bez absorpce by mělo být CD nulové, nebo aspoň rovné Baselina obyčejně krátkodoubé (ms – min) fluktuace a dlouhodobé (min – h), lépe více akumulací, měřit „čerstvé“ nulové linie V případě malých signálu se může stát, že CD není nulové vně absorpčních pásů, mělo by být alespoň rovné, jinak je něco špatně Parametry měření: Časová konstanta (time constant) t (= doba, kdy přístroj „průměruje“ data rychlost záznamu (scan speed) s, šířka pásů (bandwidth) b Mělo by být: t . s <= b/2 S/N~(t . n . I0)1/2 17

použití rychlých skenů pro nastavení citlivosti Praktické poznámky použití rychlých skenů pro nastavení citlivosti použití rozpouštědel v tabulkách kalibrace – 10-capmphor sulfuric acid 18

3. Využití chiroptických spektroskopií 1. Detekce chirality a charakterizace enantiomerní čistoty, tzv enantiomerní přebytek – dostačuje optická rotace, lze nahradit cirkulárním dichroismem, zejména, nelze-li užít sodíkové čáry D 2. Chiroptické detektory při HPLC 3. Nejvýznamnější aplikace - strukturní informace o (chirálních) molekulách Alternativní metody (metody 1. volby): Strukturní metody s vysokým (atomovým) rozlišením: difrakce X-záření, elektronová, neutronová difrakce NMR ve spojení s převodem na diastereomerní sloučeniny numerické metody skenovací a transmisní mikroskopie stanovení absolutní konfigurace pomoci VCD, ECD ve spojení s přímým výpočtem a simulací spekter – pro rigidní molekuly, často farmaceutické aplikace nahrazují pracné určení pomocí rentgenové difrakce 19

Metody určování struktury látek Chiroptické metody Obsah přednášek Základní pojmy, varianty metod Teoretické základy cirkulárního dichroismu, specifika instrumentace CD Metodologie měření ECD a VCD, praktické poznámky, aplikace 4.-6. Aplikace chiroptických metod I a II, laboratoř ECD a VCD Chiroptické metody 2012