Tvorba 3D modelu živých buněk Marie Hyblová Magdaléna Koutová Renata Rychtáriková Nové Hrady, 25.7.2013 Dobrý den, rády bychom vás seznámily s výsledky našeho projektu zaměřeného na tvorbu trojrozměrného modelu živé buňky.

Využití 3D modelu Medicína Onkologie Embryologie Výsledky tohoto výzkumu bude možné potenciálně využít v medicíně při zkoumání fyziologických stavů a třídění lidských embryí, dále např. k zkoumání patologické morfologie rakovinné buňky.

Optická mikroskopie ve světlém poli +: Jednoduchá metoda Nebarvené živé buňky -: Nízký kontrast Nízké rozlišení Jako vhodný nástroj ke studiu fyziologie a morfologie živé buňky lze použít optickou mikroskopii, a to zejména mikroskopii ve světlém poli. Výhodou tohoto typu mikroskopie oproti jiným typům je její jednoduchost z hlediska konstrukce a principu (tj. využívá k zobrazení pouze průchodu viditelného světla vzorkem). Z hlediska studia stavu buňky je další nespornou výhodnou možnost použití buňky neznačené či jinak upravené. Naopak nevýhodou tohoto typu mikroskopie je nízký kontrast pozorovaných objektů, zejména právě nebarvených biologických vzorků, či nízké rozlišení objektů vlivem rozostření.

Cíle práce Detekce organely v živé buňce 3D rekonstrukce organely Výpočet objemu organely Z tohoto důvodu byla zde v Ústavu komplexních systémů vyvinuta metoda založená na informační teorii umožňující zvýraznění hranic objektu pozorovaného optickou mikroskopií. Cílem naší práce během této stáže bylo použít tuto metodu pro detekci, rekonstrukci a výpočet objemu organel ve vertikálních skenech živé buňky.

Metodika Jako první biologický model pro studium morfologie organel byla vybrána buňka osteosarkomu kmene MG63, která byla v z-skenu snímána zdejším prototypem nanoskopu využívající jako princip právě optickou mikroskopii ve světlém poli. Unikátní vlastností tohoto přístroje je vybavení kamerou s čipem kinofilmové velikosti, umožňující uložení obrazu v 8- i 12-bitovém rozlišení. Videozesílení, které zajistí detekci objektů i velmi malé velikosti, je zajištěno dalším zpracováním výstupního obrazu. Výstupní raw formát obrazu odpovídající RGB filtrům Bayerovy masky je přepočítán na RGB obrázek čtvrtinového rozlišení. V případě 12bitového obrázku následuje konverze na 8 bit. V z-skenu buňky byla následně pomocí vícerozměrové analýzy vybrána v programu Unscrumbler X její zaostřená oblast po extrakci informační entropie série obrázků softwary Entropic Calculator a PIE Extractor. Systémovou nevýhodou uvedeného nanoskopu je nežádoucí posun pozorovaného objektu (v našem případě buňky) skenovaného vertikálně. Z tohoto důvodu bylo nutné získanou sérii buňky MG63 poloautomaticky srovnat algoritmem v programu Matlab. V programu Cell Marker byla buňka vyříznuta a opět přepočítána softwarem Entropic Calculator. My jsme počítali tzv. PDG-obrázky (Point Divergence Gain) pro 13 konstant, tzv. alfa-koeficientů Rényiho entropie. Tento typ zpracování obrazu je právě vhodný pro studium z-skenové série. Zjišťuje se změna informace obrazu, pokud zaměníme bod na určité pozici v obrázku za stejný bod v obrázku následujícím. Tento přepočet se na výstupním obrázku projeví jako změna intenzity daného bodu. Tím dojde ke zvýraznění hranic pozorovaných objektů.

Metodika Detekce organel Funkce algoritmu Vstup Prahování Poloautomatická detekce kontur Export vybraného objektu Výpočet objemu vybraného objektu Vstup PDG-1,3-Whole image Prahování B ̶ kanál, intenzity 10 ̶ 70 Samotná detekce organel byla provedena v matlabovském skriptu, umožňujícím (přečti funkce algoritmu). My jsme pro prahování a detekci kontur organel v buňce MG63 použily modrý kanál s intenzitami 10-70.

Výsledky V následujícím videu uvidíte zaostřenou oblast z-skenu lidského osteosarkomu MG63, naší první studované buňky. My jsme se pokusily vytvořit 3D model a vypočítat objem červeně zvýrazněného jadérka. Povšimněte si, že spousta jiných malých organel se v buňce pohybuje. To potom způsobuje jejich špatnou detekci v z-skenu.

Studium vlivu zobrazovací funkce nanoskopu Výsledky Studium vlivu zobrazovací funkce nanoskopu Zobrazení objektů optickou mikroskopií je vždy ovlivněno tzv. zobrazovací funkcí mikroskopu (PSF, Point Spread Function). Její vliv na zobrazení našeho jadérka byl zkoumán jako jeho objemový rozdíl, vypočítaný z PDG sérií nasnímaných a obrácených při 13 alfa-koeficientech Rényiho entropie. Bylo zjištěno, že ke změně objemu jadérka nedochází při použití Rényiho koeficientu o hodnotě 1,3. Zobrazovací funkce nanoskopu je tedy v tomto případě symetrická. Po důkladné analýze (tj. výpočtu rozdílu objemu jadérka pro nasmímané a obrácené série snímků) bylo zjištěno, že vhodnou sérií pro detekci jadérka v naší buňce je série snímků PDG-1,3-Whole image. Závislost objemu jadérka na α-koefiientu Rényiho entropie pro nasnímanou a obrácenou sérii MG63.

Výsledky Detekce jadérka Tato série tedy byla použita pro export organely pomocí skriptu v Matlabu. Zde vidíte intenzitní profily této PDG série. Jadérko bylo detekováno v prvních 40 snímcích ze zaostřené série obsahující 65 snímků. Intenzitní profily barevných kanálů PDG-1,3-Whole image série MG63.

Výsledky Vypočítaný objem jadérka: 6055 µm3 Na následujícím videu již vidíte náš nejdůležitější výsledek!!!, a to průběh z-skenu vybraného jadérka. Jeho objem je 6055 um3.

Závěr Nutnost optimalizace automatizace Během naší stáže jsme s použitím nanoskopu naskenovali a zpracovali další typy živých savčích buněk. Tyto nasnímané série budou použity pro postupnou optimalizaci a automatizaci celého procesu a ke studiu stavové trajektorie buněčných organel a tedy i celé buňky.

Poděkování Kevinovi Shi Tomáši Náhlíkovi a Honzovi Kohoutovi Renatě Rychtárikové

Děkujeme za pozornost!