Přínos imunofenotypizace k diferenciální diagnostice hematoonkologických onemocnění M.Bílý, K. Klaricová, L.Novosadová, D. Starostka, M. Wróbel Oddělení klinické hematologie NsP Havířov Prim. MUDr. L. Novosadová

Y Y Imunofenotypizace mab2 PE Typizace jednotlivých buněčných populací za využití reakce antigen – protilátka. Reakce je vizualizována označením protilátky fluorochromem (FITC, PE, PC5, aj.). Zjištění imunofenotypu dané populace. Buněčná lokalizace antigenů (markerů, znaků): Povrchová (membránová). Intracytoplazmatická. Nukleární (jaderná). Zdroje vyšetřovaného materiálu v hematologii: periferní krev kostní dřeň tělesné tekutiny (punktáty, likvor, aj.) suspenze buněk ze solidních tkání po dezintegraci Praktické provedení imunofenotypizace: Průtoková cytometrie. Fluorescenční mikroskopie. Y mab2 PE Y mab1 FITC

Možnosti vícebarevného značení (multiparametrová analýza) V jediné zkumavce vyšetřované buňky + 2 či více protilátek proti různým znakům, každá protilátka označena jiným flurochromem. Současná analýza exprese několika znaků na jedné buňce. Význam: Získání upřesňujících informací o charakteru vyšetřované populace, konfirmace diagnózy. Příklad: Znaky CD19 (B-lymfocyty) a CD5 (fyziologicky T-lymfocyty) u B-CLL : patologická subpopulace CD19+CD5+ .

Přehled CD znaků (CD = Cluster of Differentiation) T – lymfocyty : CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD2, CD1 , TCR B – lymfocyty : CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD38, CD11c, CD79b, FMC7, CD40, CD28, CD103, CD138 NK – buňky: CD16, CD56 Granulocyty a monocyty: CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD33 Progenitorové buňky: CD34, CD38, CD117 Povrchové, event.intracytoplazmatické imunoglobuliny : těžké řetězce IgG, IgA, IgM, IgD, lehké řetězce κ, λ

Průtoková cytometrie (flow cytometry) Metoda kvantitativní a kvalitativní analýzy buněčných či jiných částic, pohybujících se v proudu tekutiny, která protéká v průtokové komůrce přes laserový paprsek. Identifikace různých buněčných typů uvnitř smíšené buněčné populace, analýza jednotlivých subpopulací v rámci jedné populace. Rychlá, přesná a reprodukovatelná metoda, umožňující současné měření několika parametrů až na 104 buněk za 1 sekundu.

Schéma průtokového cytometru Laser (Air-cooled Argon Ion Laser) Čočky upravující tvar paprsku „Beam Shaping Lenses“ Průtoková kyveta „High Sensitivity Quartz Flow Cell“ Detektor pro „Forward Scatter“ „Side Scatter“ 525BP FL1 (FITC) 575BP FL2 (RD1) 620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5) 488DL 488BK 550DL 600DL 645DL

Klinická aplikace imunofenotypizace v hematologii a hematoonkologii Analýza erytrocytů Analýza trombocytů Stanovení retikulocytů Funkční vyšetření granulocytů Vyšetření diferenciálního rozpočtu leukocytů Typizace leukémií: AL – AML, ALL chronické leukémie (např. CLL) Typizace lymfomů - v leukemické fázi - vyšetření lymfatických uzlin, sleziny Imunofenotypizace dalších jednotek: myelom, MDS, PNH Analýza onkoproteinů Sortování (třídění) buněk dle antigenní výbavy (progenitorové buňky CD34) Cytometrická DNA analýza (ploidie, obsah DNA, RNA)

Přehled hematoonkologických diagnóz 1/1995 – 2/2002 Celkem vyšetřeno 4350 jednotlivých vzorků, tj. 49 870 znaků. Lymfoproliferace n Akutní leukémie B-CLL 251 AML 36 Leukem. B-NHL 40 ALL B - linie 6 B-HCL 5 T - ALL 1 T-LGL 4 Bifenotypová AL 2 M. Waldenström PCL B-CLL / PLL 3 Jiné stavy T-PLL MDS 12 Richterova PNH transformace B-CLL Myeloidní sarkom

Definice lymfocytózy: Zvýšení počtu lymfocytů v periferní krvi absolutní > 4.0 x 109 / l u dospělých relativní Diferenciální diagnostika pomocí membránových znaků: monoklonální ( primární, leukemická) lymfocytóza polyklonální ( sekundární, reaktivní ) lymfocytóza Důležitost rozlišení patologické lymfocytózy od reaktivní.

Monoklonalita v lymfoidních řadách (z pohledu imunofenotypu) B-linie 1. Lehké řetězce imunoglobulinů kappa, lambda. Průměrný poměr 1.5 : 1 . Normální rozsah 0.7-2.5 . Monoklonalita κ:λ , λ:κ > 3:1 . 2. Těžké řetězce imunoglobulinů ( molekuly Ig). Monoklonalita: 1 Ig třída k součtu ostatních >3:1 . 3. Charakteristický imunofenotyp

Monoklonalita v lymfoidních řadách (z pohledu imunofenotypu) T linie: 1. Zvýšená exprese pan-T antigenů. 2. Exprese aberantních fenotypů, uniformní imunofenotyp. 3. Porušený poměr CD4/CD8. 4. Typ TCR. 5. Délka trvání T- lymfocytózy ( absolutní počet >4.0 x 109 /l po dobu minim. 3 - 6 měsíců ).

Imunofenotyp u chronických B - lymfoproliferací Legenda: B – CLL : B – chron. lymf. leukémie MCL : mantle – cell lymfom B – PLL : B – prolymfocyt. leukémie FL : folikulární lymfom HCL : hairy – cell leukémie MZL : lymfom z marginální zóny HCL – V : HCL – variant LPL : lymfoplazmocytoid. lymfom (imunocytom) PCL : plazmocelulární leukémie SLVL : splenický lymfom s vilóz. lymfocyty WM : Waldenström. makroglobulinémie ND : neudáno

Skórovací systém pro B – CLL (podle Matutes a spol.) BODY 1 MEMBRÁN. ZNAK SmIg slabá pozitivita střední/silná pozitivita CD5 pozitivní negativní CD23 FMC7 CD79b (dříve CD22) slabě pozit./negat. Rozmezí skóre od 5 (typická B - CLL) do 0 (atypická B - CLL).

Přehled stavů diagnostikovaných na OKH NsP Havířov od 6/1997 do 2/2002 Vyšetřeno 249 pacientů s nově zjištěnou absolutní lymfocytózou ( > 4.0 x 109 / l lymfocytů v perif. krvi ). Soubor pacientů: 249 dospělých pacientů ve věku od 19 do 98 let ( průměrný věk 64.9 let ) Poměr muži : ženy 145 : 104 ( 1.39 : 1 ) Počet leukocytů v KO: 5.4 – 536.0 x 109 / l Lymfocyty v diferenciálním rozpočtu: 0.04 - 0.99 numfr Absolutní počet lymfocytů: 4.1 – 530.0 x 109 / l Převaha řetězců κ : λ 145 pacientů - poměr 1.1 - 776 : 1 Převaha řetězců λ : κ 100 pacientů - poměr 1.1 - 829 : 1

Přehled stavů s absolutní lymfocytózou diagnostikovaných na OKH NsP Havířov od 6/1997 do 2/2002 B-CLL 179 pacientů 71.9 % Reaktivní lymfocytóza 36 pacientů 14.5 % Leukemizovaný B-NHL 19 pacientů 7.6 % MLUS 5 pacienti 2.0 % B- CLL/PLL 3 pacienti 1.2 % T-PLL 2 pacienti 0.8 % T-LGL PCL B-HCL 1 pacient 0.4 % ( n = 249 )

Stavy bez absolutní lymfocytózy, s počtem lymfocytů < 4x109/l Vyšetřeno 18 pacientů bez absolutní lymfocytózy ( < 4.0x109 /l lymfocytů v periferní krvi ), u kterých vedla imunofenotypizace k dg. lymfoproliferace. Soubor pacientů: 18 dospělých pacientů ve věku od 41 do 79 let ( průměrný věk 63.6 let ) Poměr muži : ženy 10 : 8 Počet leukocytů v KO: 2.5 – 14.2 x 109 / l Lymfocyty v diferenciálním rozpočtu: 0.15 - 0.78 numfr Absolutní počet lymfocytů: 1.1 – 4.0 x 109 / l Převaha řetězců κ : λ 14 pacientů - poměr 2.8 – 69 : 1 Převaha řetězců λ : κ 4 pacienti - poměr 4.4 – 86 : 1

Stavy bez absolutní lymfocytózy, s počtem lymfocytů < 4x109/l Leukemizovaný B-NHL 7 pacientů 38.9 % B-CLL 4 pacienti 22.2 % MLUS Richterova transformace B-CLL 1 pacient 5.6 % B-HCL Waldenströmova makroglobulinemie ( n = 18 )

Kazuistika č.1 B.D., M, 60 let V dubnu 2000 náhodně zachycená extrémní leukocytóza na bázi lymfocytózy. Krevní obraz: hemoglobin 125 g/l leukocyty 485x109/l trombocyty 96x109/l diff.: lymfocyty 0.91 numfr lymfocyty absolutně 441 x 109/l Imunofenotypizace lymfocytů (4/2000): CD 19+ 98.5 % SmIgM 91.5 % CD 19+/5+ 98.4 % SmIgD 90.4 % CD 23+ 78.6 % CD 19+/+ 92.7 % CD 79b+ 82.0 % CD 19+/+ 0.3 % FMC 7+ 5.0 % Poměr / 309 : 1 Závěr: B-CLL, skóre dle Matutes a spol. 3/5.

Kazuistika č.2 C.K., M, 63 let Před léčbou Po léčbě Dg. B-CLL od 6/1997, skóre B-CLL 4/5. Léčba nejprve chlorambucilem (Leuke- ran), poté fludarabinem ( 5 kúr, 2/2000- 7/2000) Charakteristika Před léčbou Po léčbě lymfocytů fludarabinem fludarabinem Leukocyty (109/l) 149.8 3.3 Lymf. diff.(numfr) 0.92 0.31 Lymf. absol. (109/l) 137.8 1.0 CD 19+ 87.5 % 91.2 % CD 19+/5+ 87.5 % 91.2 % CD 23+ 81.0 % 85.2 % CD 19+/+ 1.6 % 0.3 % CD 19+/+ 90.7 % 87.2 % Poměr / 57 : 1 291 : 1 Závěr: I přes leukopenii a lymfopenii není po léčbě B-CLL remise na úrovni imunofenotypu dosaženo !

Kazuistika č. 3 J. K., M, 42 let V 5/2001 při preventivní prohlídce zjištěna trombocytopenie, leukocyty početně v normě, v diff. lymfocytóza. Dále splenomegalie. Cytomorfologicky některé lymfocyty s vilózními výběžky, pojato podezření na HCL. KO v 5/2001: Hb 171 g/l leuk. 5.4 x 109/l tromb. 53 x 109/l diff.: segm. 0.14 ly 0.82, mo 0.04 numfr Imunofenotypizace patologických buněk PK: CD19 89.5% CD19+/κ+ 4.8% CD11c 94.1% CD19+/λ+ 75.6% CD22 86.7% CD25 81.6% λ : κ = 16 : 1 CD103 88.3% CD5 8.8% SmIgG 90.8% CD23 6.4% SmIgA 79.5% Závěr: Vlasatobuněčná leukémie (HCL). (Potvrzeno histologií kostní dřeně.)

Závěry I. Imunofenotypizace představuje u hematoonkologických onemocnění zásadní diagnostickou a diferenciálně diagnostickou metodu. Multiparametrová analýza buněk zvyšuje přesnost diagnózy a lépe charakterizuje imunofenotyp vyšetřované populace. Jednotlivé hematoonkologické jednotky se vyznačují poměrně charakteristickým až zcela diagnostickým imunofenotypem, který může mít i prognostický význam a jehož lze např. využít k průkazu relapsu onemocnění a monitoraci minimální reziduální choroby. Imunofenotypizace průtokovou cytometrií se vyznačuje vysokou senzitivitou a specifitou (citlivost metody cca 10-3 buněk), rychlostí a reprodukovatelností.

Závěry II. Při záchytu absolutní lymfocytózy, zejména perzistující, je nutné vyloučit monoklonální charakter lymfoidní populace. K tomuto účelu se jeví imunofenotypizace ve většině případů jako suverénní diagnostická metoda, která často objasní monoklonalitu i u lymfoproliferací s relativní lymfocytózou. Vysoká senzitivita i specifita při stanovení imunofenotypu buněk vede často k odhalení patologického lymfoidního klonu podstatně dříve než při vyšetření dalšími běžnými metodami. Pacient s monoklonální lymfocytózou by měl být komplexně vyšetřen. U dosud nevyhraněného imunofenotypu jsou nutné dispenzarizace a kontroly.

Spolupracující pracoviště FNsP Ostrava: ÚKH Interní klinika NsP Karviná – Ráj: HTO Interní oddělení Oddělení TRN ORL oddělení Karvinská hornická nemocnice, a.s. : Interní oddělení Nemocnice Třinec : Interní oddělení HTO Krevní centrum Frýdek - Místek Nemocnice Hranice : HTO Nemocnice Frýdek – Místek : HTO Interní oddělení Urologické odd. Odd. následné péče Nemocnice Bohumín : Interní oddělení Chirurgické odd. Městská nemocnice Český Těšín : OKBH Nemocnice Orlová a LDN : Interní oddělení Neurologické odd. LDN Praktičtí lékaři