Protilátky využívané v diagnostice Monoklonální protilátka – je produkována klonem buněk pocházejících z jedné plazmatické buňky; váže se velmi specificky k určitému epitopu antigenu Polyklonální protilátka – je produkt mnoha klonů plazmatických buněk; jde o směs protilátek namířených proti různým epitopům antigenu či směsi antigenů

Vyšetřování parametrů humorální imunity

Imunochemické metody řada metod založených na principu reakce: antigen (Ag) + protilátka (Ab) → imunokomplex (IK) stanovujeme buď Ag nebo Ab (obecně analyt)

Vyšetřování humorální imunity Imunoprecipitace v roztoku - Nefelometrie - Turbidimetrie Imunoprecipitace v gelu - Imunodifuze - Elektroforéza Aglutinace (Ag – korpuskulární charakter; IgM, IgG) Komplementfixační testy (Ab+Ag+komplement) Imunoreakce se značenými protilátkami (EIA, ELISA, RIA) Imunobloting (southerblot, notherbloting,westernbloting) imunofluorescence

Imunoprecipitační křivka

Zákalové metody: nefelometrie a turbidimetrie Použití: používá se prostanovení vzorků o vyšších koncentracích proteinů stanovení množství (koncentrací) běžných proteinů lidského séra (jednotlivé třídy Ig, CRP, RF, složky komplementu C3 a C4, C1 INH)

Nefelometrie ↑ Z →→→→ K (Ag-Ab) ↓ D Princip: základem metody je měření intenzity odraženého světla od zákalu vzniklého reakcí Ag – Ab. Z – zdroj (laser, výbojka) K – kyveta se vzorkem D – detektor D ↑ Z →→→→ K (Ag-Ab) ↓ D  

Nefelometrie Vyhodnocení: dle kalibrační křivky sestavené pomocí standardu (Ag o známé koncentraci) a získaných odpovídajících hodnot intenzity odraženého světla intenzita odraženého světla koncentrace Ag

Turbidimetrie Princip: měří úbytek intenzity světla po jeho průchodu kyvetou obsahující IK   Zdroj – Kyveta – Detektor jsou umístěny v jedné přímce: Z →→→→ IK (Ag-Ab) → D Vyhodnocení: dle kalibrační křivky

EIA – enzyme immunoassay skupina metod Společný princip: použije se Ag nebo Ab značená enzymem (Ag*, Ab*) → po navázaní s hledaným Ag nebo Ab ze vzorku je tak enzymem označen celý IK (Ag-Ab*, Ab-Ag*) → enzym reaguje s přidaným substrátem za vzniku výsledného produktu, který detekujeme Vyhodnocení: pomocí kalibrační křivky (Ag o známé koncentraci – standardy- a k nim změřené vlastnosti produktu – př. intenzita zbarvení)   Použití: kvantitativní stanovení malých množství některých proteinů (př. specifických Ab, hormonů, cytokinů, TU markerů...)

EIA – enzyme immunoassay Dělení EIA metod: a) dle typu enzymu, substrátu a detekce výsledného produktu: ELISA (fotometrická detekce barevného produktu) FEIA (fluorometrická detekce fluorescence výsledného produktu) LEIA (luminometrická detekce světla uvolněného/emitovaného při změně chemické struktury substrátu) b) dle postupu: heterogenní x homogenní kompetitivní x nekompetitivní

ELISA

ISAC test

RIA – radioimunoanalýza Princip: Ag nebo Ab se značí radioaktivním isotopem (rozdíl od metody EIA)→ následně označen IK vysoká citlivost a specifičnost nevýhoda: vyšší nároky na technické vybavení, bezpečnost práce Použití: př. stanovování hladin některých hormonů, TU markerů, ...

Nepřímá imunofluorescence Postup: 1. inkubace pacientova séra (Ab) se substrátem (Ag) fixovaným na podložním sklíčku 2. inkubace s anti-lidskou protilátkou značenou např. FITC (anti-human IgM/FITC, anti-human IgG/FITC, anti-human IgA/FITC) 3. detekce pomocí fluorescenčního mikroskopu

Průtoková cytometrie

Průtoková cytometrie Metoda používaná pro analýzu buněk v suspenzi Používána pro analýzu krevních leukocytů, bb. kostní dřeně, popř. analýzu bb. v moči, likvoru, výpotcích, bronchoalveolární laváži atd. Průtoková cytometrie detekuje u sledovaného vzorku buněk - FSC (forward scatter)-přímý rozptyl, velikost bb. - SSC (side scatter)- boční rozptyl, granularita bb. - fluorescenci – na buňky se váží monoklonální protilátky značené fluorochromy (FITC, PE, Texas red…)

Průtokový cytometr Průtokový cytometr se skládá ze 3 částí A) systém fluidní B) systém optický C) systém elektronický

Významné povrchové znaky leukocytů CD3+ zralé T lymfocyty CD4+ subpopulace pomocných T lymfocytů (30 - 60%) CD8+ subpopulace cytotoxických T lymfocytů (15 - 30%) CD25+ aktivované T lymfocyty (1 - 5%) CD19+ zralé B lymfocyty (5 - 15%) CD56+ NK buňky (5 - 15%) CD14+ buňky: monocyty CD15+ buňky: granulocyty CD38+ buňky: plazmatické buňky

Analýza výsledků 1) rozdělení bb. podle velikosti (FSC) a granularity (SSC) na základní populace (lymfocyty, monocyty, granulocyty), graficky znázorněny v tzv. histogramu, viz obr. SSC neutro mono lymfo FSC

Analýza výsledků - fluorescence Stanovení celkové populace T lymfocytů a pomocných lymfocytů

Průtoková cytometrie – příklady využití kvantitativní testy: vyšetření subpopulací lymfocytů, NK, aktivovaných T lymfocytů; poměru CD4/CD8 (dg. AIDS), onkoproteiny (dg. malignit), atd. b) kvalitativní testy - funkční: vyšetření fagocytózy (ingesce, oxidativní vzplanutí) testy aktivace (př. T-lymfocytů, bazofilů) 22

Test aktivace bazofilů (BAT) Tento test je založen na expresi aktivačního znaku (CD63) na povrchu periferních bazofilů po jejich expozici alergenu in vitro; pomocné vyšetření v diagnostice atopie Princip : heparinizovanou krev smísíme se stimulačním pufrem (IL-3) a alergenem dojde-li k přemostění sousedních FcRI s navázanými IgE na povrchu bazofilů alergenem, dojde k aktivaci bazofilů a expresi aktivační povrchové molekuly CD63 potom přidáme značenou monoklonální protilátku proti znaku CD63 (anti-CD63-FITC) a stanovíme tento znak pomocí průtokové cytometrie

Test aktivace bazofilů anti-CD63-FITC CD 63 FcεRI (receptor pro IgE) IgE Alergen