Biochemie – základní genetické pochody Josef Trögl

Genetická informace Pořadí bází určuje genetickou informaci Gen = úsek NK kódující nějakou funkci Strukturní gen – kóduje strukturu bílkoviny Gen pro RNA – kóduje strukturu RNA Soubor všech genů = genom Kromě genů jsou v NK i další úseky Regulační (řídící) Nekódující – bez funkce nebo s neznámou funkcí – evolučně pokročilejší organismy mají více nekódujících sekvencí

Genetické pojmy Intron = sekvence DNA nekódující bílkovinu vmezeřená do strukturního genu Sestřih = proces odstraňování intronů ze strukturního genu Promotor = sekvence DNA uvozující gen nebo operon Operon = sekvence několika genů se společnou regulací Kodon = trojice bází kódující jednu aminokyselinu v peptidovém řetězci Antikodon = sekvence tří bazí komplementární ke kodonu

Typy RNA mRNA (messanger, mediátorová) = přenos exprimovaných genů z jádra na ribozómy rRNA (ribozomální) = stavební funkce v ribozómech, uplatňují se při translaci tRNA (transferová) = čtení genetického kódu, přenos aminokyselin při syntéze proteinů

Základní genetické pochody Replikace (zdvojení) = kopírování genetické informace do nové molekuly NK Transkripce (přepis) = kopírování malé části genetické informace z DNA do RNA Translace (překlad) = syntéza primární struktury bílkoviny podle informace v RNA

Základní genetické pochody DNA replikace transkripce reverzní transkripce replikace RNA translace „Základní dogma molekulární biologie“ Bílkovina

Replikace Nutná pro předání genetické informace další generaci Enzym DNA polymeráza Rozpletení dsDNA Ke každému vláknu je dosyntetizováno druhé komplementární Semikonzervativní (polovina nové molekuly DNA pochází od rodiče, polovina je nová)

Semikonzervativní replikace

P G C T A P P P A A T G A T T C P P P P P G C T A

Funkční protein Exprese genů transkripce translace gen mRNA polypeptid Soubor pochodů vedoucích od genu po funkční bílkovinu Možná regulace na všech úrovních transkripce translace gen mRNA polypeptid posttranslační modifikace transport Funkční protein

Transkripce Přepis jednoho nebo několika genů z DNA do mRNA Enzym RNA polymeráza

Reverzní transkripce Pouze u tzv. retrovirů (např. HIV) Přepis z RNA do DNA Enzym reverzní transkriptáza – nekontroluje chyby  mutace Vzniklá DNA je integrována (začleněna) do genomu  může vzniknout rakovina

Translace mRNA Syntéza bílkovin podle genetické informace Probíhá na ribozómech Ribozóm se posouvá po mRNA a syntetizuje peptid Čtení genetické informace podle genetického kódu mRNA

Genetický kód Soubor kódů pro všechny aminokyseliny 20 kódovaných aminokyselin Jedna aminokyselina je kódována třemi bázemi (tzv. triplet nebo kodon) Triplet = 64 kombinací  genetický kód je degenerovaný (více kódů pro jednu aminokyselinu) Genetický kód je univerzální (= až na výjimky stejný ve všech organismech)

Genetický kód

Čtení genetického kódu 5’- A U U C G G C U U A G G - 3’ N- Ile Arg Leu Arg -C Nukleové kyseliny jsou čteny i syntetizovány od 5’ konce Bílkoviny jsou čteny i syntetizovány od N konce

Čtecí rámec 1 aminokyselina je kódována 3 bázemi = záleží na tom, kde se začne číst Čtecí rámec, jsou 3 možné začátky čtení, ale jen jeden je správný 5’- A U U C G G C U U A G G - 3’ N- Ile Arg Leu Arg -C

Čtecí rámec 5’- A U U C G G C U U A G G - 3’ N- Ile Arg Leu Arg -C

Čtecí rámec 5’- A U U C G G C U U A G G - 3’ N- Ile Arg Leu Arg -C N- Phe Gly Leu -C

Čtecí rámec 5’- A U U C G G C U U A G G - 3’ N- Ile Arg Leu Arg -C N- Phe Gly Leu -C N- Ser Ala STOP -C

Genomika Genetická informace uložena v DNA U některých virů i v RNA Genomika = věda zabývající se genomy a genetickou informací Velikost genetické informace se udává v párech bazí (base pairs = bp)

Velikost genomů Organismus Bp Bakterioág MS2 3569 Escherichia coli 4.106 Mycoplasma genitalium 580 000 Nanoarchaeum equitans 490 885 Saccharomyces cerevisiae 2.107 Populus trichocarpa (topol) 4,8.108 Homo sapiens sapiens (člověk) 3,2.109 Fritillaria assyriaca 1,3.1011 Amoeba dubia (měňavka) 6,7.1011

Genetická informace Jaderná Mimojaderná Chromózómy = hlavní „velké“ DNA Mimojaderná Plasmidy = malé kruhové DNA u bakterií DNA v organelách (mitochondrie, plastidy)

Bakteriální genóm Obvykle kruhová DNA Obvykle jeden chromozóm Volně v cytoplazmě DNA obalena alkalickými aminy (spermin a spermidin) Časté plasmidy, i několik desítek Bez intronů Geny uspořádány do operonů

Eukaryotický genom Lineární DNA Obvykle více chromozómů (člověk 46) DNA je uložena v jádře obaleném dvojitou membránou Zahuštěna do kompaktní struktury pomocí alkalických bílkovin (histonů) Plasmidy výjimečné Geny mají introny Operony nenacházíme

Archeální genóm Mezistupeň mezi bakteriemi a eukaryoty Obvykle lineární Volně v cytoplasmě DNA obalena bílkovinami podobnými eukaryotickým histonům Primitivní introny Plasmidy (méně než bakterie) Geny organizované do operonů

Plasmidy Krátké cyklické úseky DNA Výskyt zejména u bakterií V buňce může být i několik stovek plasmidů, stejných i různých Některé plasmidy vzájemně nekompatibilní (nemohou být v jedné buňce) Nezávisle se replikují Občas vymizení

Plasmidy Postaru nazývané faktory Kódují vlastnosti, které bakterie k životu nutně nepotřebuje rezistenci vůči antibiotikům (tzv. RTF – Resistence Transfer Factor) nové metabolické dráhy (např. odbourávání uhlovodíků apod.) produkce toxinů

Plasmidy Význam v genetickém inženýrství umělé plasmidy s požadovanými vlastnostmi

Replikace u bakterií Dvojsměrná 3 fáze Iniciace (zahájení) v tzv. místě ori (origin = počátek) Elongace (prodlužování) Terminace (zakončení)

Replikační enzymy u bakterií DNA polymerázy multienzymové komplexy 3 druhy (DNA-pol I. II. a III.) dNTP + DNAn  PP + DNAn+1 dNTP = dATP, dGTP, dCTP, dTTP napojování nukleotidů na 3’-konec neumí začátek řetězce, jen napojovat, potřebuje tzv. primer (očko) = krátká sekvence DNA nebo RNA DNA primáza syntetizuje krátký fragment RNA - primer

dTTP dCTP N H 2 O P - dATP dGTP

Replikační enzymy u bakterií DNA ligáza spojuje delší řetězce DNA DNA helikázy rozplétají dvojšroubovici na jednotlivá vlákna

Iniciace replikace 1. Rozpoznání ori místa 2. Navázání helikáz DnaA proteiny – najdou ori místo a oddělí v něm oba řetězce DNA ori místo je bohaté na AT páry = jen 2 H-můstky = snadno se oddělí vznik tzv. replikační vidlice 2. Navázání helikáz na oba konce vidlice se naváže helikáza a začne rozplétat DNA 3. Navázání DNA polymeráz a dalších replikačních enzymů

Iniciace replikace A A A A

Iniciace replikace A A A A

Iniciace replikace A A A A H H

Iniciace replikace A H H A A A

Iniciace replikace A H H A A A

Iniciace replikace Pol A H Pol H A A A

Iniciace replikace Pol A H Pol H A A A

Elongace DNA Syntézu obou řetězců katalyzuje enzymový komplex DNA-polymerázy III. Semidiskontinuální = jeden řetězec se syntetizuje nepřetržitě (vedoucí řetězec = leading strain) a jeden po kratších úsecích (opožďující se řetězec = lagging strain) Okazakiho fragmenty = krátké úseky DNA (1000-2000 nukleotidů) DNA polymeráza syntetizuje řetězec ve směru 5’-3’, ale řetězce mají opačnou orientaci cca 500 nukletidů / s kontrola chyb

Semidiskontinuální elongace 3’ 5’ vedoucí řetězec Pol 5’ 3’ Okazakiho fragmenty opožďující se řetězec 3’ 5’

Elongace DNA Syntéza opožďujícího se řetězce: Syntéza RNA primeru (primáza) Elongace fragmentu (DNA polymeráza I.) Odstranění primeru (DNA polymeráza I.) Zaplnění mezery (DNA polymeráza I.) Spojení řetězců (DNA ligáza)

Semidiskontinuální elongace 3’ 5’ vedoucí řetězec Pol 5’ 3’ primery opožďující se řetězec 3’ 5’

Terminace replikace Na tzv. ter místě Tus protein – inhibice helikázy

Replikace plasmidů Analogická repliklaci chromozómů Časově oddělená replikace vedoucího a opožďující se řetězce – tzv. replikace valivou kružnicí nejprve je syntetizován vedoucí řetězec, který vytlačí původní – 1. kopie plasmidu k vytlačenému původnímu řetězci se pomocí Okazakiho fragmentů dosyntetizuje nový řetězec – 2. kopie plasmidu

Replikace plasmidů

Replikace u eukaryot V principu stejná jako u bakterií Odlišnosti jiné DNA polymerázy (ale s podobnou funkcí) replikace probíhá na mnoha místech naráz eukaryotické chromozómy jsou lineární  na 5’ konci nových řetězců chybí úsek, který není na co navázat – speciální enzym telomeráza 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’

Replikace u archeí Velice podobná bakteriální replikaci DNA polymerázy strukturně podobné eukaryotickým, ale s podobnou funkcí jako u bakterií

Transkripce u bakterií 3 fáze Iniciace (zahájení) Elongace (prodlužování) Terminace (zakončení) Enzym RNA-polymeráza 5 podjednotek – a2bb’s Transkripce je zahajována na promotoru – uvozující úsek DNA různé promotory u různých genů Rychlost cca 40 nukleotidů / s řádově pomalejší než replikace

Sigma faktor Podjednotka s (sigma faktor) má za úkol rozpoznat promotor bakterie mají více sigma faktorů pro geny různého typu Síla promotoru = pravděpodobnost zahájení transkripce geny se silnějším promotorem jsou více exprimovány závisí na sekvenci promotoru i sigma faktoru

Pozitivní a negativní řetězec Transkripcí dsDNA vzniká ssRNA Přepisuje se jen jedno vlákno ze dvou = negativní vlákno Nepřepisované vlákno = pozitivní vlákno Analogie s fotografií – negativ a pozitiv

Iniciace transkripce s a2bb’ 1. Spojení sigma-faktoru s RNA polymerázou s a2bb’ - řetězec +řetězec promotor přepisované geny

Iniciace transkripce a2bb’ s 2. Sigma podjednotka rozpozná promotor a naváže RNA polymerázu na DNA s a2bb’ - řetězec +řetězec promotor přepisované geny

Iniciace transkripce 3. Rozpletení DNA - řetězec +řetězec

Iniciace transkripce 4. Zahájení syntézy RNA - řetězec +řetězec

Elongace RNA 5. Syntéza RNA – sigma-faktor se oddělí - řetězec

Terminace transkripce Pomocí vlásenky terminátor = koncový úsek přepisované RNA palindromatická sekvence (symetrická) = páruje se sama se sebou a vzniká vlásenka vlásenka „vykolejí“ RNA polymerázu Pomocí r-faktoru bílkovina, rozpoznávající terminátor interakce s RNA polymerázou a ukončení transkripce

Transkripce u eukaryot V principu stejná jako u bakterií Odlišnosti více RNA polymeráz odlišných od bakteriální odlišné promotory k zahájení transkripce jsou potřeba iniciační faktory (bílkoviny); obvykle několik složitější iniciace složitější terminace, nejčastěji pomocí tzv. polyadenylačního signálu = sekvence AATAAA Posttranskripční úpravy mRNA

Posttranskripční úpravy mRNA U eukaryot je přepsaná mRNA ještě podrobena tzv. posttranskripčním úpravám vytvoření tzv. čepičky na 5’-konci komplex se specifickými proteiny sestřih = odstranění intronů polyadenylace 3’-konce

Transkripce u archeí Podobnosti i odlišnosti proti bakteriím a eukaryím Podobnosti s eukaryotickou transkripcí podobné RNA-polymerázy podobné iniciační faktory Podobnosti s bakteriální transkripcí žádné posttranskripční úpravy mRNA podobné promotory přepis operonů do jedné mRNA

Bakteriální translace

tRNA Prostředník při překladu z genetického kódu do „řeči“ aminokyselin Jednu aminokyselinu může přenášet více tRNA = izoakceptorové Ve struktuře tRNA jsou zařazeny i nestandardní nukleotidy (pseudouridin, 1-methylguanozin…) – vznik modifikací standardních nukleotidů 74-95 nukleotidů sekundární struktura připomíná jetelový lístek

tRNA Vazebné místo pro aminokyselinu Smyčky Antikodon

Antikodon Sekvence 3 nukleotidů komplementární s kodonem pro danou aminokyselinu Nestandardní nukleotidy umožňují rozšířené párování

Aktivace aminokyselin Proces napojování aminokyselin na tRNA Pro každý pár aminokyselina-tRNA existuje jeden enzym aminoacyl-tRNA-syntetáza Rozpoznává správné aminokyseliny i tRNA Syntetizuje jejich vazbu (energie ze štěpení ATP) aa + ATP  aa-AMP + PP aa-AMP + tRNA  aa-tRNA + AMP

Aktivace aminokyselin Proces napojování aminokyselin na tRNA Pro každý pár aminokyselina-tRNA existuje jeden enzym aminoacyl-tRNA-syntetáza Rozpoznává správné aminokyseliny i tRNA Syntetizuje jejich vazbu (energie ze štěpení ATP) aa + ATP  aa-AMP + PP aa-AMP + tRNA  aa-tRNA + AMP

Bakteriální ribozómy Kuličky složné z bílkovin a rRNA Označení komponent podle sedimentačního koeficientu celý bakteriální ribozóm má sedimentační koeficient 70S 16S-rRNA, 23S-rRNA, 5S-rRNA Dvě podjednotky malá 30S velká 50S

Vazebná místa na ribozómu Vazebné místo pro mRNA Aminoacylové místo (A-místo) – vazba nepřipojené aa-tRNA Peptidylové místo (P-místo) – vazba už hotového peptidového řetězce Výstupní místo pro tRNA (E-místo) – odchod deacylované tRNA

Průběh translace Iniciace Elongace – prodlužování řetězce Terminace rozpoznání čtecího rámce zařazení první aminokyseliny (formylmethionin) iniciační faktory (IF) - bílkoviny Elongace – prodlužování řetězce elongační faktory (EF) Terminace terminační (nesmyslný) kodon = nekóduje žádnou aminokyselinu, ale konec řetězce účast terminačních faktorů (RF)

Iniciace translace 1.Rozpad ribozómu na podjednotky E P A

Iniciace translace 2.Navázání fMet-tRNA fMet E P A

Iniciace translace 3.Navázání mRNA správné umístění pomocí tzv. Shine-Dalgarnovy sekvence E P A fMet

Shine-Dalgarnova sekvence Sekvence AGGA na mRNA, která se páruje s UCCU na 16S-rRNA Zajišťuje správné umístění mRNA na ribozóm ribozóm 3’ 5’ 16S-rRNA UCCU AGGA AUG iniciační kodon 5’ 3’ mRNA

Iniciace translace 4.Znovuspojení ribozomálních podjednotek E P A fMet

Elongace polypeptidového řetězce 6. Navázání další aminokyseliny do A místa Trp E P A fMet

Elongace polypeptidového řetězce 7. Vznik peptidové vazby fMet E P A Trp

Elongace polypeptidového řetězce 8. Posun ribozómu E A fMet P Trp

Elongace polypeptidového řetězce 9. Navázání další aminokyseliny E A fMet P Trp Lys

Elongace polypeptidového řetězce 10. Vznik peptidové vaby fMet Trp E A P Lys

Elongace polypeptidového řetězce 11. Posun ribozómu fMet Trp E A P Lys

Elongace peptidového řetězce mRNA

Terminace translace Terminační faktory RF1 a RF2 rozpoznají terminační kodón a za spolupráce s RF3 způsobí uvolnění tRNA, peptidu a rozpad ribozómu na podjednotky

Rychlost proteosyntézy 10-20 aminokyselin / s chybovost cca 1 nesprávná aminokyselina na 2000 správných

Translace polygenních RNA U bakteriích je mnoho mRNA polygenních = nesou více genů (např. operony) U každého genu nová iniciace translace

Návaznost transkripce a translace U bakterií dochází k rychlému navazování transkripce a translace na nehotovou mRNA už nasedají ribozómy a překládají polypeptid na jedné RNA může být současně 10-30 ribozómů posunujících se „za sebou“

RNA pol DNA RNA

peptid ribozóm ribozóm ribozóm ribozóm ribozóm ribozóm RNA pol DNA RNA

Eukaryotická transalce V principu podobná bakteriální ale s odlišnostmi ribozómy jsou větší a odlišné (80S) volné vázané na endoplasmatické retikulum – syntéza membránových bílkovin první aminokyselinou je methionin a ne formylmethionin eukarya nepoužívají Shine-Dalgarnovu sekvenci, správný začátek transalce je rozpoznáván pomocí čepičky více translačních faktorů

Eukaryotická transalce Prostorové oddělení eukaryální transkripce a translace transkripce probíhá v jádře translace probíhá mimo jádro – nutný transport Časové oddělení translace probíhá teprve po dokončení všech posttranskripčních úprav

Archeální transalce Podobnosti s bakteriální transalcí podobné ribozómy používání Shine-Dalgarnovy sekvence Podobnosti s eukaryální translací podobné translační faktory