Replikace DNA Milada Roštejnská Helena Klímová Tato prezentace se zabývá Replikací DNA. Milada Roštejnská Helena Klímová

Obsah Co je výsledkem replikace Replikační počátky a replikační vidličky DNA-polymerasa Asymetričnost replikační vidličky Korektorská schopnost DNA-polymerasy Primasa Okazakiho fragmenty Kliknutím na zvolený nadpis přejdete na příslušný snímek. Na obsah se vždy vrátíte kliknutím na animační tlačítko „Obsah“. Replikační aparát Animace Použitá literatura

Nově syntetizovaný řetězec DNA Replikace DNA dává vznik dvěma novým vláknům. Obr. 1. Replikace – schéma Templát (matrice) A T G C A T G C A T G C Obsah Nově syntetizovaný řetězec DNA

Replikační počátky a replikační vidličky Celý proces replikace začínají iniciační proteiny v místech, které se nazývají replikační počátky. dvoušroubovice DNA Replikační počátek Replikační počátky se v průběhu replikace zvětšují za vzniku tzv. replikačních vidliček. Lidský genom, který má přibližně 3x109 deoxynukleotidů, má zhruba 10 000 replikačních počátků. Jejich velký počet umožňuje lidské buňce zreplikovat veškerou DNA během relativně krátké doby. Replikační vidlička Obsah

Obr. 2. Replikační vidlička Replikační vidličky V replikačních vidličkách jsou navázány proteiny replikačního aparátu, které se pohybují ve směru replikace a rozvíjejí dvoušroubovicovou strukturu za současné syntézy nového řetězce. Na snímku je vytvořená animace znázorňující rozpletení dvoušroubovicové struktury. Obr. 2. Replikační vidlička Obsah

Obr. 3. Obousměrná replikace Replikační vidličky V jednom replikačním počátku se vytvoří dvě replikační vidličky, které se pohybují směrem od sebe, a proto je tato replikace nazývána obousměrná. Replikační vidlička Směr replikace Směr replikace Začátek replikace Obr. 3. Obousměrná replikace Obsah

Většinu nové DNA polymerizuje DNA-polymerasa III. Důležitým enzymem je DNA-polymerasa, která syntetizuje nové vlákno DNA podle původního řetězce. Tento enzym katalyzuje připojování nukleotidů na 3'-konec rostoucího řetězce DNA za vzniku fosfodiesterové vazby mezi 3'-OH skupinou řetězce a 5'-fosfátovou skupinou přidávaného nukleotidu. DNA je syntetizována ve směru 5' → 3'. Většinu nové DNA polymerizuje DNA-polymerasa III. DNA-polymerasa I vyplňuje vzniklé mezery v řetězci DNA; opravovač chyb v párování bází v DNA (3'→5' exonukleasová aktivita, hydrolyzuje DNA od 3'-konce); odbourává primery (5'→3' exonukleasová aktivita, hydrolyzuje DNA od 5 '-konce). DNA-polymerasa III syntetizuje DNA; opravovač chyb v párování bází v DNA (3'→5' exonukleasová aktivita, hydrolyzuje DNA od 3'-konce). Nukleotidy vstupují do reakce jako energeticky bohaté deoxynukleosidtrifosfáty (např. dATP) a dodávají energii polymerizační reakci. Obsah

Obr. 4. Vznik fosfodiesterové vazby 3' 3' 5' 5' Templátový Řetězec (DNA) T A T A Nově syntetizovaný Řetězec (DNA) A T A T 3'-konec Energie uvolněná hydrolýzou jedné fosfodiesterové vazby v deoxynukleosidtrifosfátu je dostatečná pro kondenzační reakci, při které se váže deoxynukleotidový monomer (dAMP, dTMP, dGMP a dCMP) do nově syntetizovaného řetězce za současného uvolnění difosfátu. 5'-konec G C G C Fosfodiesterová vazba 5' 5' Obsah 3' Obr. 4. Vznik fosfodiesterové vazby

DNA-polymerasa 3' 5' Vedoucí řetězec 5' 3' 3' Spustit animaci 5' Vedoucí řetězec 5' 3' 3' Animaci spustíte kliknutím na tlačítko „Spustit animaci“. Deoxynukleosidtrifosfáty (na obrázku znázorněny zeleně) jsou pomocí enzymu DNA-polymerasy připojovány k vedoucímu řetězci (znázorněn oranžově). Deoxynukleosidtrifosfáty (dATP, dGTP, dTTP a dCTP) Enzym: DNA-polymerasa III Obsah 5' Obr. 5. Replikace na vedoucím řetězci

Asymetričnost replikační vidličky DNA-polymerasa je schopna syntetizovat nové vlákno pouze prodlužováním 3'-konce DNA. V replikační vidličce nastává problém, protože původní dvoušroubovice se skládá ze dvou antiparalelních řetězců (je asymetrická). 5' Snímky č. 10 – 14 týkající se asymetričnosti replikační vidličky je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. Obrázek znázorňuje antiparalelnost dvouřetězcové DNA. 3' 3' 5' Obsah Obr. 6. Antiparalelní řetězce DNA

Asymetričnost replikační vidličky Jeden nový řetězec je v replikační vidličce syntetizován podle templátu ve směru 3'→ 5'. (Vzniká 5'→ 3' řetězec) Druhý nový řetězec je v replikační vidličce syntetizován podle templátu ve směru 5'→ 3'. 5' 3' 5' 3' Snímky č. 10 – 14 týkající se asymetričnosti replikační vidličky je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. 3' 5' 3' 5' Replikační počátek Obsah Obr. 6. Antiparalelní řetězce DNA

Asymetričnost replikační vidličky Jeden nový řetězec je v replikační vidličce syntetizována podle templátu ve směru 3'→ 5'. (Vzniká 5'→ 3' řetězec) Druhý nový řetězec je v replikační vidličce syntetizován podle templátu ve směru 5'→ 3'. 3' Vedoucí řetězec 5' 5' 3' Snímky č. 10 – 14 týkající se asymetričnosti replikační vidličky je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. Pomocí šipek je znázorněn průběh procesu replikace. Obr. 7. Směry replikace 5' 3' 3' Váznoucí řetězec Obsah 5'

Asymetričnost replikační vidličky Neexistuje DNA-polymerasa, která by dokázala prodlužovat 5'-konec DNA. Tudíž v tomto směru roste diskontinuálně tzn., že jsou ve směru 5'→ 3' syntetizovány krátké úseky DNA (Okazakiho fragmenty), které jsou následně spojovány v kontinuální řetězec. Řetězec, který je tvořen kontinuálně, se nazývá vedoucí řetězec. Snímky č. 10 – 14 týkající se asymetričnosti replikační vidličky je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. Řetězec, který je tvořen diskontinuálně, se nazývá opožďující se nebo váznoucí řetězec. Obsah

Asymetričnost replikační vidličky Vedoucí řetězec Váznoucí řetězec 5' 3' 5' 3' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 5' Okazakiho fragmenty Templát pro syntézu nového řetězce DNA Směr pohybu replikační vidličky 5' 3' Snímky č. 10 – 14 týkající se asymetričnosti replikační vidličky je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. nejnověji nasyntetizovaná DNA Obsah Obr. 8. Asymetričnost replikační vidličky

Korektorská schopnost DNA-polymerasy DNA-polymerasa katalyzuje reakci: (DNA)n + dNTP ⇄ (DNA)n + 1 + difosfát. DNA-polymerasa je schopna hydrolyzovat DNA od 3'-konce (tzv. 3'→5' exonukleasová aktivita). Připojí-li se chybný nukleotid, vznikne nestabilní produkt (nukleotid se chybně páruje s nukleotidem v templátu), čímž dojde k posunutí rovnováhy ve směru výchozích látek. Snímek lze z učiva středoškolské biochemie vynechat. difosfát = P2O74- (PPi) Proto DNA-polymerasa je velice přesně párující enzym, který udělá průměrně jednu chybu na 107 zreplikovaných párů bází. Obsah

DNA-polymerasa neumí začít syntetizovat nové vlákno. Primasa DNA-polymerasa neumí začít syntetizovat nové vlákno. Existuje jiný enzym - primasa, která dokáže spojit dva volné nukleotidy. Primasa nesyntetizuje DNA, ale krátké úseky RNA majících cca 10 nukleotidů. Snímky č. 16 – 17 týkající se enzymu primasy je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. Při syntéze vedoucího řetězce je třeba pouze jeden RNA-primer. Syntéza opožďujícího se řetězce je však diskontinuální a vyžaduje neustále tvorbu RNA-primerů. Tyto úseky se párují na základě komplementarity s templátovým řetězcem a poskytují 3'-konec pro DNA-polymerasu. Slouží tedy jako primer pro syntézu DNA. Obsah

Obr. 9. Replikace na váznoucím řetězci (1. část) Primasa 3' Vedoucí řetězec Spustit animaci 1. Primasa 2. DNA-polymerasa III 5' 5' 3' Snímky č. 16 – 17 týkající se asymetričnosti replikační vidličky je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. Animace se spustí po kliknutí na tlačítko „Spustit animaci“. Animace zobrazuje replikaci na váznoucím řetězci. Enzym primasa nejprve nasyntetizuje krátké úseky RNA (přibližně 10 nukleotidů dlouhé), poté enzym DNA-polymerasa III připojuje k těmto primerům správné deoxynukleosidtrifosfáty (dATP, dCTP, dGTP a dTTP). Pro syntézu vedoucího řetězce je třeba pouze jeden primer, kdežto syntéza váznoucího řetězce vyžaduje neustále tvorbu RNA-primerů. Okazakiho fragmenty 3' Váznoucí řetězec 5' Obsah Obr. 9. Replikace na váznoucím řetězci (1. část)

Okazakiho fragmenty Opožďující řetězec je tvořen mnoha oddělenými úseky tzv. Okazakiho fragmenty (o velikosti 1000-2000 nukleotidů). Na vytvoření souvislého vlákna DNA z Okazakiho fragmentů jsou třeba tři enzymy: 1. DNA-polymerasa I (exonukleasová funkce) – odstraňuje RNA primery; Snímky č. 18 – 19 týkající se Okazakiho fragmentů je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. 2. DNA-polymerasa I– nahrazuje RNA-primery DNA; 3. DNA-ligasa – pospojí všechny úseky dohromady. Obsah

Obr. 10. Replikace na váznoucím řetězci (2. část) Okazakiho fragmenty 3' Vedoucí řetězec Spustit animaci 3. DNA-polymerasa I (exonukleasová funkce) 5' 4. DNA-polymerasa I 5' 3' 5. DNA-ligasa Snímky č. 18 – 19 týkající se Okazakiho fragmentů je možné z učiva středoškolské biochemie vynechat. Animace se spustí po kliknutí na tlačítko Spustit animaci. DNA-polymerasa I (exonukleasová funkce) odstraňuje RNA-primery (na snímku jsou RNA-primery znázorněny fialově). DNA-polymerasa I tyto primery nahradí DNA. DNA-ligasa spojí 5'-fosfátový konec prvního úseku s 3'-hydroxylovým koncem druhého úseku (znázorněno zelenou vazbou). 3' Váznoucí řetězec 5' Obsah Obr. 10. Replikace na váznoucím řetězci (2. část)

Replikační aparát Replikace DNA vyžaduje spolupráci několika druhů enzymů. Replikační aparát umožňuje vznik a posun replikační vidličky a syntézu nové DNA. Obr. 11. Replikační aparát 5' 3' Rodičovská DNA Vedoucí řetězec Váznoucí řetězec Vazebný protein pro udržení jednořetězcové struktury Primasa DNA-helikasa DNA-polymerasa Svírací protein Nově syntetizovaný řetězec RNA-primer Nový Okazakiho fragment Okazakiho fragment Jeden z možných modelů replikační vidličky. Předpokládá se však, že obě dvě DNA-polymerasy pracují jako multimerní komplex, tzn. že váznoucí řetězec je stočen tak, aby DNA-polymerasy mohly být v kontaktu. Obsah

Replikační aparát - helikasa (rozvíjí dvoušroubovicovou strukturu) Enzym helikasa se pohybuje podél DNA a současně rozvíjí dvoušroubovicovou strukturu DNA. Na jednořetězcovou DNA nasedají SSB-proteiny (single-strand binding proteins), které ochraňují DNA před znovuspárováním. Obsah Obr. 12. Rozvíjení dvoušroubovicové struktury

Replikace je proces semikonzervativní 5' 3' 3' 5' Replikace DNA je semikonzervativní, protože výsledkem replikace jsou dvě dceřinné dvoušroubovice, z nichž každá má jedno vlákno původní (mateřské – znázorněno oranžově) a jedno nově nasyntetizované (znázorněno modře a zeleně). 3' 5' 5' 3' Obsah Obr. 13. Dceřinná vlákna DNA

Animace pro zopakování Obsah

Replikace na vedoucím řetězci 3' Spustit animaci 5' Vedoucí řetězec 5' 3' 3' Animace se spustí po kliknutí na tlačítko „Spustit animaci“. Animace znázorňuje připojování deoxynukleosidtrifosfátu k vedoucímu řetězci. Enzym katalyzující tuto reakci se nazývá DNA-polymerasa III. Deoxynukleosidtrifosfáty (dATP, dGTP, dTTP a dCTP) Enzym: DNA-polymerasa III Obsah

Replikace na váznoucím řetězci (1. část) 3' Vedoucí řetězec Spustit animaci 1. Primasa 2. DNA-polymerasa III 5' 5' 3' Animace se spustí po kliknutí na tlačítko „Spustit animaci“. Animace zobrazuje replikaci na váznoucím řetězci. Enzym primasa nejprve nasyntetizuje krátké úseky RNA (přibližně 10 nukleotidů dlouhé), poté enzym DNA-polymerasa III připojuje k těmto primerům správné deoxynukleosidtrifosfáty (dATP, dCTP, dGTP a dTTP). Pro syntézu vedoucího řetězce je třeba pouze jeden primer, kdežto syntéza váznoucího řetězce vyžaduje neustále tvorbu RNA-primerů. Okazakiho fragmenty 3' Váznoucí řetězec Obsah 5'

Replikace na váznoucím řetězci (2. část) 3' Vedoucí řetězec Spustit animaci 1. DNA-polymerasa I (exonukleasová funkce) 5' 2. DNA-polymerasa I 5' 3' 3. DNA-ligasa Animace se spustí po kliknutí na tlačítko „Spustit animaci“. DNA-polymerasa I (exonukleasová funkce) odstraňuje RNA-primery (na snímku jsou RNA-primery znázorněny fialově). DNA-polymerasa I tyto primery nahradí DNA. DNA-ligasa spojí 5'-fosfátový konec prvního úseku s 3'-hydroxylovým koncem druhého úseku (znázorněno zelenou vazbou). 3' Váznoucí řetězec Obsah 5'

Průběh replikace Vedoucí řetězec 3' 5' 5' 3' 5' 3' 3' Váznoucí řetězec Pomocí šipek je znázorněn průběh procesu replikace. 3' Váznoucí řetězec 5' Obsah

Použitá literatura Obsah [1] ALBERTS, B. a kol. Základy buněčné biologie. Ústí nad Labem: Espero Publishing, 1997. [2] NEČAS, O. a kol. Obecná biologie pro lékařské fakulty. Jinočany: Nakladateství H&H, 2000. [3] KUBIŠTA, V. Buněčné základy životních dějů. Praha: Scientia, 1998. Obsah