Techniky molekulární biologie a genetiky MUDr. Michal Jurajda, Ph.D. 3. 4. 2015
Struktura genomu
Základní pojmy Genom – kompletní genová výbava organismu Gen – úsek řetězce DNA přepisovaný do RNA, včetně předcházejících následných a vložených úseků nezbytných pro realizaci genetické informace. Lokus – místo, které zaujímá určitý gen na chromozomu Alela – konkrétní forma genu
Genetika populací Genofond – souhrn všech alel všech genů v určité populaci.
DNA Jaderná Mitochondriálni
Realizace genetické informace Genotyp Fenotyp
Organizace genomu
DNA
Genetický kód
Genetický kód je univerzální Genetický kód je „degenerovaný“
gen 3´ 5´ DNA 3´ 5´ RNA 5´ 3´ Transkripce RNA transkript 5´ 1 I 2 I 3 Kódující vlákno 3´ 5´ DNA Promotor Exon 1 Intron 1 E2 I 2 E 3 I 3 Exon 4 3´ 5´ templátové vlákno RNA 5´ 3´ Transkripce RNA transkript 5´ 1 I 2 I 3 I 4 3´ 5´UTR Processing (capping, adice poly A, splicing) Zralá mRNA Cap 1 2 3 4 AAAAAn 3´UTR 5´UTR Translace 1 2 3 4 Protein NH2 COOH
Chromozóm
Karyotyp
Vlivy zevního prostředí Mutace Epigenetické efekty - methylace, acetylace DNA
Mutace
Základní pojmy Gen Alela
Mutace Změna v genetickém kódu (v pořadí bází) v genetické výbavě jedince.
Příčiny vzniku mutací Chyba při duplikaci DNA Fyzikální vlivy (UV, ionizující záření) Chemické mutageny Viry SHM (somatic hypermutation) proces diversifikace imunoglobulinových genů.
Typy mutací podle dědičnosti Mutace somatické, nepřenosné na potomky (vyjímka rostliny) Mutace zárodečné
Somatické mutace Týkají se jedné somatické buňky Pokud se buňka dělí může vzniknout klon buněk nesoucí danou mutaci. Vznik nádorových klonů Klonální diferenciace, selekce
Zárodečné mutace Přítomné ve všech buňkách postiženého organismu Přenosné na další generace
Vliv mutace na „fitness“ organismu Je relativní s ohledem na zevní podmínky Pozitivní Negativní Neutrální
Mutace a polymorfismy Každá nová změna sekvence DNA v populaci se objevuje ve formě mutace. Vyskytne se jen u jednoho jedince v populaci a pokud je zárodečná dostává se do dalších generací.
Mutace x polymorfizmy Mutace Genetické polymorfizmy Selekce Neutrální mutace – genetický drift Genetické polymorfizmy Populační četnost vzácnější alely aspoň 1%
Typy mutací podle změny struktury DNA Bodové mutace tranzice A G, C T transverze A/G C/T
Bodové mutace v kódující oblasti genu Silent mutations: kódují stejnou aminokyselinu Neutral mutations: kódují podobnou aminokyselinu Missense mutations: kódují jinou aminokyselinu Nonsense mutations: kódují STOP kodon a zkracují protein
Inzerce Delece Jedna nebo více bází replikace repetitivních sekvencí, transpozony Změna čtecího rámce Splice site mutations Delece
Chromozomální aberace - strukturální Amplifikace Delece Translokace Inverze Fúzní geny: bcr-abl
LOH Loss of heterozigosity Ztráta heterozygotnosti – např. u nádorových bb.
Nomenklatura DNA 76A>C , 76_78del , 76_77insT Protein M235T, ΔF508 Jedinečný identifikátor rs6200616T
Monogenní a multigenní nemoci
Terminologie Symptom Syndrom Nemoc jako nosologická jednotka příznak (chorobný) Syndrom skupina příznaků Nemoc jako nosologická jednotka obvykle definována podle příznaků a příčin (etiologie) Pojem normality
Nemoc Nosologická jednotka popsaná deskriptivně a empiricky Molekulárně patofyziologický děj, manifestující se různě za daných podmínek zevního prostředí
Dělení nemocí podle etiologických faktorů Nemoci z vnějších příčin Nemoci z vnitřních příčin Choroby z jedné „velké“ příčiny Multifaktoriální choroby
Nemoci z vnějších příčin Příčiny: Fyzikální Chemické Biologické
Nemoci z genetického hlediska Nemoci monogenní Nemoci multigenní multifaktoriální
Multifaktoriální nemoci Projevují se obyčejně v postreprodukčním věku – selekční tlak Jsou projevem nerovnováhy genomu a zevního prostředí – civilizační nemoci
Multifaktoriální dědičnost
Efekt zkoumané alely Je alela riziková jen pro jednu chorobu, nebo pro více chorob? Je alela pro některou chorobu riziková a pro jinou se uplatňuje jako ochranný faktor?
Studium multifaktoriální dědičnosti
Asociační studie
Výběr vzorku pacientů a vzorku kontrol Severly affected x Extremely normal Affected with early onset x Normal eldery Positive family history x Negative family history Affected x Normal with intense environmetal exposure Eldery survivor x Young I. Day (ed.), Molecular Genetic Epidemiology – A Laboratory Perspective
Confoundings „matoucí faktory“ Rozvrstvení populace Linkage disekvilibrium mezi studovaným markrem a skutečnou nemoc způsobující alelou Rozdíl v genetických a environmentálních rizikových faktorech mezi pacienty a kontrolami
Kauzální asociace Konzistence asociace Síla asociace Biologická věrohodnost Biologický gradient Existence analogií Specificita – těžko očekávatelná u pleiotropních genů Experimentální důkaz The Pharmacogenomics Journal (2002) 2, 349–360
Metody detekce genových polymorfismů
Typ polymorfismu SNP Short repeats Insertion/deletion
Metody detekce nukleotidových polymorfismů Hledání přítomnosti neznámé alely Detekce známých alel
Využívané metodiky PCR RFLP Real time PCR PAGE Kapilární elektroforéza ELFO na agaróze Real time PCR PAGE SSCP, heteroduplexní analýza Kapilární elektroforéza v podstatě varianta PAGE
Strategie volby metody Flexibilita Cena Dostupnost Rychlost vyšetření
PCR 1983 Kary Mullis 1993 Nobelova cena
Amplifikace DNA
Základní komponenty reakce voda pufr dNTP (dATP+dTTP+dCTP+dGTP) MgCl2 Taq polymeráza primers templát
Teplotní režim 96ºC Iniciální denaturace 96ºC denaturace 40-72ºC annealing 72ºC elongace 72ºC závěrečná elongace 4ºC zchlazení 30x
Elektroforéza v agarovém gelu
+ -
Přímá sekvenace Umožní detekovat dosud nepoznané mutace/polymorfismy Drahá Relativně zdlouhavá Metody využívající sekvenační instrumentárium
PCR s následnou analýzou délky produktů Pokud je polymorfismus způsoben insercí/delecí většího počtu bází, produkt PCR analyzujeme přímo na agarové elektroforéze. V případě analýzy počtu dinukleotidových repetic používáme kapilární elektroforézu. Alelově specifické primery – poskytnou produkt jen za přítomnosti dané aley
PCR s následnou RFLP Pokud polymorfismus způsobuje vznik restrikčního místa, podrobíme produkt PCR působení daného enzymu a na agarové elektroforéze pozorujeme výsledek. Mismatch primery – umožňují vnést restrikční místo do blízkosti SNP a umožní jeho detekci pomocí endonukleáz
Real-time PCR Různé systémy sond (TaqMan, FRET) Melting curve analysis
Metody využívající kapilární sekvenátor SNPlex SNaPshot
Microarrays and chips
High throughput techniques Snaha zvýšit množství zpracovaného materiálu a získaných dat za kratší čas. Větší nároky na přístrojové vybavení. Větší nároky na bioinformatickou podporu při zpracování dat.
High throughput techniques Arrays SAGE High-throughput sequencing
Co je microarray Skleněná nebo plastová destička/membrána s maticí mikroskopických bodů, které obsahují DNA sondy
K čemu je microarray dobrá? Technologie microarrays umožňuje analyzovat během jednoho experimentu až desetitisíce genů. Přináší ohromnou časovou úsporu a úsporu analyzovaného vzorku. Umožňuje automatizovat proces analýzy DNA
Nevýhody DNA microarrays Vyžadují obvykle nákladné přístrojové vybavení. Samotné arrays jsou poměrně nákladné, ale při přepočtu na analýzu jednoho genu je tato zpravidla levnější než při použití klasických postupů. Výsledky získané paralelním studiem několika tisíc genů vyžadují speciální postupy při statistickém zpracování.
Pracovní postup „spotování“ arraye – specializovaná firma Izolace analyzované DNA/RNA/cDNA Označení studované NA pomocí např. chemiluminiscenční značky. Hybridizace s array. Analýza v readeru Statistické zpracování (clusterová analýza)
Praktické použití DNA arrays Expression profiling Genotyping, SNP detection Comparative genomic hybridization
Podobné technologie Agilent Technology, Lab-on-a-Chip
Tissue microarrays