Geneticky podmíněné nemoci

Prezentace na téma: "Geneticky podmíněné nemoci"— Transkript prezentace:

1 Geneticky podmíněné nemoci
MUDr. Michal Jurajda, Ph.D.

2 Geneticky podmíněné nemoci

3 Které choroby jsou geneticky podmíněné?
Dědičné (hereditární) Získané multifaktoriální (genové polymorfismy) somatické mutace Vrozené (kongenitální) nemusí být geneticky podmíněné a dědičné

4 Základní pojmy Genom – kompletní genová výbava organismu (buňky)
Gen – úsek řetězce DNA přepisovaný do RNA, včetně předcházejících následných a vložených úseků nezbytných pro realizaci genetické informace. Lokus – místo, které zaujímá určitý gen na chromozomu Alela – konkrétní forma genu

5 Genetika populací Genofond – souhrn všech alel všech genů v určité populaci.

6 DNA Jaderná Mitochondriálni nemoci CNS s svalové onemocnění

7 Realizace genetické informace
Genotyp Fenotyp

8 Organizace genomu

9 DNA

10 Genetický kód

11 Genetický kód je univerzální
Genetický kód je „degenerovaný“

12 gen 3´ 5´ DNA 3´ 5´ RNA 5´ 3´ Transkripce RNA transkript 5´ 1 I 2 I 3
Kódující vlákno 3´ 5´ DNA Promotor Exon 1 Intron 1 E2 I 2 E 3 I 3 Exon 4 3´ 5´ templátové vlákno RNA 5´ 3´ Transkripce RNA transkript 5´ 1 I 2 I 3 I 4 3´ 5´UTR Processing (capping, adice poly A, splicing) Zralá mRNA Cap 1 2 3 4 AAAAAn 3´UTR 5´UTR Translace Protein NH2 COOH

13 Chromozóm

14 Karyotyp

15 Vlivy zevního prostředí
Mutace Epigenetické efekty - methylace, acetylace DNA

16 Mutace

17 Základní pojmy Gen Alela

18 Mutace Změna v genetickém kódu (v pořadí bází) v genetické výbavě jedince.

19 Příčiny vzniku mutací Chyba při duplikaci DNA
Fyzikální vlivy (UV, ionizující záření) Chemické mutageny Viry SHM (somatic hypermutation) proces diversifikace imunoglobulinových genů.

20 Typy mutací podle dědičnosti
Mutace somatické, nepřenosné na potomky (vyjímka rostliny) Mutace zárodečné

21 Somatické mutace Týkají se jedné somatické buňky
Pokud se buňka dělí může vzniknout klon buněk nesoucí danou mutaci. Vznik nádorových klonů Klonální diferenciace, selekce

22 Zárodečné mutace Přítomné ve všech buňkách postiženého organismu
Přenosné na další generace

23 Vliv mutace na „fitness“ organismu
Je relativní s ohledem na zevní podmínky Pozitivní Negativní Neutrální

24 Mutace a polymorfismy Každá nová změna sekvence DNA v populaci se objevuje ve formě mutace. Vyskytne se jen u jednoho jedince v populaci a pokud je zárodečná dostává se do dalších generací.

25 Mutace x polymorfizmy Mutace Genetické polymorfizmy Selekce
Neutrální mutace – genetický drift Genetické polymorfizmy Populační četnost vzácnější alely aspoň 1%

26 Typy mutací podle změny struktury DNA
Bodové mutace tranzice A  G, C  T transverze A/G C/T

27 Bodové mutace v kódující oblasti genu
Silent mutations: kódují stejnou aminokyselinu Neutral mutations: kódují podobnou aminokyselinu Missense mutations: kódují jinou aminokyselinu Nonsense mutations: kódují STOP kodon a zkracují protein

28 Inzerce Delece Jedna nebo více bází
replikace repetitivních sekvencí, transpozony Změna čtecího rámce Splice site mutations Delece

29 Chromozomální aberace - strukturální
Amplifikace Delece Translokace Inverze Fúzní geny: bcr-abl

30 LOH Loss of heterozigosity
Ztráta heterozygotnosti – např. u nádorových bb.

31 Nomenklatura DNA 76A>C , 76_78del , 76_77insT Protein M235T, ΔF508
Jedinečný identifikátor rs T

32 Monogenní a multigenní nemoci

33 Terminologie Symptom Syndrom Nemoc jako nosologická jednotka
příznak (chorobný) Syndrom skupina příznaků Nemoc jako nosologická jednotka obvykle definována podle příznaků a příčin (etiologie) Pojem normality

34 Nemoc Nosologická jednotka popsaná deskriptivně a empiricky
Molekulárně patofyziologický děj, manifestující se různě za daných podmínek zevního prostředí

35 Dělení nemocí podle etiologických faktorů
Nemoci z vnějších příčin Nemoci z vnitřních příčin Choroby z jedné „velké“ příčiny Multifaktoriální choroby

36 Nemoci z genetického hlediska
Nemoci monogenní Nemoci multigenní multifaktoriální

37 Multifaktoriální nemoci
Projevují se obyčejně v postreprodukčním věku – selekční tlak Jsou projevem nerovnováhy genomu a zevního prostředí – civilizační nemoci

38 Multifaktoriální dědičnost

39 Efekt zkoumané alely Je alela riziková jen pro jednu chorobu, nebo pro více chorob? Je alela pro některou chorobu riziková a pro jinou se uplatňuje jako ochranný faktor?

40 Studium multifaktoriální dědičnosti

41 Asociační studie

42 Výběr vzorku pacientů a vzorku kontrol
Severly affected x Extremely normal Affected with early onset x Normal eldery Positive family history x Negative family history Affected x Normal with intense environmetal exposure Eldery survivor x Young I. Day (ed.), Molecular Genetic Epidemiology – A Laboratory Perspective

43 Confoundings „matoucí faktory“
Rozvrstvení populace Linkage disekvilibrium mezi studovaným markrem a skutečnou nemoc způsobující alelou Rozdíl v genetických a environmentálních rizikových faktorech mezi pacienty a kontrolami

44 Kauzální asociace Konzistence asociace Síla asociace
Biologická věrohodnost Biologický gradient Existence analogií Specificita – těžko očekávatelná u pleiotropních genů Experimentální důkaz The Pharmacogenomics Journal (2002) 2, 349–360

45 Genové manipulace Genová terapie Zárodečná terapie – ovlivnění zygoty Somatické terapie – ovlivnění somatických bb.

46 Přenos genů Gen Vektor Cílové buňky retroviry a adenoviry liposomy
přenos v organismu in vivo transfer přenos do buněk odebraných z organismu a následně vrácených ex vivo transfer

47 Problémy genové terapie
Bezpečnost Inzerční deaktivace genu – dvě kopie – relativně malé riziko Inzerční aktivace genu – onkogeny Etické otázky

48 Gene knock-out Příprava animálních modelů lidských onemocnění

49 Metody detekce genových polymorfismů

50 Typ polymorfismu SNP Short repeats Insertion/deletion

51 Metody detekce nukleotidových polymorfismů
Hledání přítomnosti neznámé alely Detekce známých alel

52 Využívané metodiky PCR RFLP Real time PCR PAGE Kapilární elektroforéza
ELFO na agaróze Real time PCR PAGE SSCP, heteroduplexní analýza Kapilární elektroforéza v podstatě varianta PAGE

53 Strategie volby metody
Flexibilita Cena Dostupnost Rychlost vyšetření

54 PCR 1983 Kary Mullis 1993 Nobelova cena

55 Amplifikace DNA

56 Základní komponenty reakce
voda pufr dNTP (dATP+dTTP+dCTP+dGTP) MgCl2 Taq polymeráza primers templát

57 Teplotní režim 96ºC Iniciální denaturace 96ºC denaturace
40-72ºC annealing 72ºC elongace 72ºC závěrečná elongace 4ºC zchlazení 30x

58 Elektroforéza v agarovém gelu

59 + -

60 Přímá sekvenace Umožní detekovat dosud nepoznané mutace/polymorfismy
Drahá Relativně zdlouhavá Metody využívající sekvenační instrumentárium

61 PCR s následnou analýzou délky produktů
Pokud je polymorfismus způsoben insercí/delecí většího počtu bází, produkt PCR analyzujeme přímo na agarové elektroforéze. V případě analýzy počtu dinukleotidových repetic používáme kapilární elektroforézu. Alelově specifické primery – poskytnou produkt jen za přítomnosti dané aley

62 PCR s následnou RFLP Pokud polymorfismus způsobuje vznik restrikčního místa, podrobíme produkt PCR působení daného enzymu a na agarové elektroforéze pozorujeme výsledek. Mismatch primery – umožňují vnést restrikční místo do blízkosti SNP a umožní jeho detekci pomocí endonukleáz

63 Real-time PCR Různé systémy sond (TaqMan, FRET) Melting curve analysis

64 Metody využívající kapilární sekvenátor
SNPlex SNaPshot

65 Microarrays and chips

66 High throughput techniques
Snaha zvýšit množství zpracovaného materiálu a získaných dat za kratší čas. Větší nároky na přístrojové vybavení. Větší nároky na bioinformatickou podporu při zpracování dat.

67 High throughput techniques
Arrays SAGE High-throughput sequencing

68 Co je microarray Skleněná nebo plastová destička/membrána s maticí mikroskopických bodů, které obsahují DNA sondy

69 K čemu je microarray dobrá?
Technologie microarrays umožňuje analyzovat během jednoho experimentu až desetitisíce genů. Přináší ohromnou časovou úsporu a úsporu analyzovaného vzorku. Umožňuje automatizovat proces analýzy DNA

70 Nevýhody DNA microarrays
Vyžadují obvykle nákladné přístrojové vybavení. Samotné arrays jsou poměrně nákladné, ale při přepočtu na analýzu jednoho genu je tato zpravidla levnější než při použití klasických postupů. Výsledky získané paralelním studiem několika tisíc genů vyžadují speciální postupy při statistickém zpracování.

71 Pracovní postup „spotování“ arraye – specializovaná firma
Izolace analyzované DNA/RNA/cDNA Označení studované NA pomocí např. chemiluminiscenční značky. Hybridizace s array. Analýza v readeru Statistické zpracování (clusterová analýza)

72

73 Praktické použití DNA arrays
Expression profiling Genotyping, SNP detection Comparative genomic hybridization

74 Podobné technologie Agilent Technology, Lab-on-a-Chip

75 Tissue microarrays

76