Bazofily a mastocyty a jejich význam v imunitních reakcích

Mastocyty (žírné buňky) a)slizniční mastocyty - lokalizace: ve sliznicích dýchacího a gastrointestinálního traktu - produkují: histamin, heparin, serotonin, cytokiny, tryptázu a další enzymy, leukotrien C4 - účast: alergie a parazitózy, zvýšeny při aktivaci TH2 b) pojivové mastocyty - lokalizace: převážně v pojivu - produkují: tryptázu a chymázu a další enzymy, prostaglandin D2 - účast: při alergii a parazitozách se neúčastní, zvýšeny při fibróze

Funkce mastocytů - obrana proti parazitárním infekcím - regulace imunitní odpovědi - uplatňují se při zánětu, při angiogenezi, při remodelaci tkání - za patologických okolností jsou zodpovědné za časný typ přecitlivělosti

Funkce mastocytů - podílejí se na udržování fyziologických funkcí sliznic - přispívají k normálnímu metabolismu pojivových tkání - komunikace mezi imunitním a nervovým systémem

Aktivace mastocytů Žírné buňky mohou být stimulovány k degranulaci: prostřednictvím přímého poškození (opiáty, alkohol, a některá antibiotika) propojením Fc receptorů pro IgE prostřednictvím anafylatoxinů (C3a, C4a, C5a)

Schema aktivace mastocytu - navázání multivalentního antigenu ( mnohobuněčného parazita) pomocí IgE na vysokoafinní Fc receptor pro IgE (FcRI) - agregace několika molekul FcRI iniciace degranulace mastocytu ( fúze cytoplazmatických granulí s povrchovou membránou a uvolnění jejich obsahu) aktivace metabolismu kyseliny arachidonové (leukotrien C4, prostaglandin PGD2) zahájení produkce cytokinů (TNF, TGF, IL-4,5,6…)

Receptory mastocytů - Fc receptor pro IgG - vysokoafinní Fc receptor pro IgE (FcRI) - Fc receptor pro IgG - receptory pro komplementové fragmenty C3a,C4a,C5a (aktivace degranulace nezávislé na IgE) - povrchové adhezivní molekuly (  integriny, L- selektin) - receptory pro růstové faktory (IL-3, IL-4, SCF)

Sekreční produkty mastocytů - cytoplazmatická granula: hydrolytické enzymy proteoglykany (heparin, chondroitinsulfát) biogenní aminy (histamin,serotonin) Histamin způsobuje vasodilataci, zvýšení vaskulární permeability, erytém, edém, svědění, kontrakci hladké svaloviny bronchů, zvýšení peristaltiky střev, zvýšení sekrece hlenu slizničními žlázkami v respiračním traktu a GITu. metabolity kys. arachidonové (leukotrien C4, prostaglandin PGD2) cytokiny (TNF, TGF, IL-4,5,6…)

Bazofily diferencují se z myeloidního prekurzoru bývají považovány za cirkulující formu mastocytů receptorovou výbavou, obsahem granul, mechanismy stimulace a funkcemi jsou velmi podobné mastocytům jsou zodpovědné za vznik anafylaktického šoku aktivační znak bazofilů: CD 63, (CD 203)

Imunitní mechanismy zánětu (lokální a systémová reakce)

Zánět Je souhrn fyziologických reakcí na porušení integrity organismu, které vedou k ochraně proti infikování poškozeného místa, k lokalizaci poškození a jeho zhojení. První signály k rozvoji zánětlivých reakcí pocházejí od mastocytů, fagocytů a od látek uvolněných z poškozených buněk a součástí mezibuněčné hmoty. Odpověď organismu - lokální - systémová

Lokální odpověď organismu na zánět Projevy - bolest (dolor), teplo (calor), zčervenání (rubor), otok (tumor) a ztrátou funkce (funkcio laesa)

Lokální odpověď organismu na zánět zvýšení permeability cév ( vazoaktivní aminy, složky komplementu C3a, C5a, leukotrieny…; otok v místě zánětu ) zvýšení exprese adhezivních molekul na endoteliích aktivace koagulačního, fibrinolytického, komplementového a kininového systému ovlivnění místních nervových zakončení ( prostaglandiny, bolest ) změny regulace teploty ( IL- 1, IL-6, TNF, prostaglandiny )

Systémová odpověď na zánět je závislá na rozsahu poškození a délce trvání lokálního zánětu horečka (prozánětlivé cytokiny TNF, IL-1, IFN stimulují hypotalamové centrum termoregulace) mobilizace tkáňového metabolismu indukce exprese Hsp (heat-shock-proteins; fungují jako chaperony) produkce proteinů akutní fáze (CRP, SAP, C3, C4; opsonizace a aktivace komplementu)

zvýšená jaterní syntéza některých sérových transportních proteinů ( ceruloplasmin, transferin ) zvýšená syntéza proteázových inhibitorů ( makroglobulín ) leukocytóza Septický šok – při masivním průniku mikroorganismů do krevního oběhu Anafylaktický šok – vyvolán alergenem, degranulace bazofilů a aktivace komplementu

Reparace poškozené tkáně - eliminace poškozených buněk fagocyty - aktivace fibroplastických mechanismů - aktivace angiogeneze - regenerace a remodelace tkání

Cytokiny ( tkáňové hormony )

Cytokiny regulační proteiny a glykoproteiny produkované leukocyty i jinými buňkami základní regulátory imunitního systému uplatňují se i mimo imunitní systém (angiogeneze, regenerace tkání, kancerogeneze, ovlivnění řady mozkových funkcí,embryoníální vývoj…) cytokiny - sekretované - membránové (zajištěno lokální působení, v membráně zakotveny sekvencí asi 20 hydrofóbních AK; CD 80, CD86, CD40L, FasL..)

pleiotropní účinek působí v kaskádě cytokinová síť cytokinový systém je redundantní působení cytokinů - autokrinní - parakrinní - endokrinní - jsou označovány jako interleukiny (vyjímka: TNF, lymfotoxin, TGF, interferony, CSF a růstové faktory)

B lymfocyt komunikuje s makrofágem a T lymfocytem pomocí cytokinů

Přehled cytokinů: interleukiny ( IL-1 až IL-23 ) chemokiny ( IL-8 a příbuzné molekuly ) interferony ( IFN-, -, - ) transformující růstové faktory ( TGFTGF ) faktory stimulující kolonie ( G-CSF, M-CSF, GM-CSF ) faktory nekrotizující nádory ( TNF-, lymfotoxin ) jiné růstové faktory (SCF, EPO, FGF, NGF,LIF )

Rozdělení cytokinů podle funkce: Prozánětlivé cytokiny (IL-1 a , IL-6, 8, 12, 18, TNF) Protizánětlivé cytokiny (IL-1Ra, IL-4, IL-10, TGF ) Cytokiny s aktivitou růstových faktorů hemopoetických bb. ( IL-2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 14, 15, CSF, SCF, LIF, EPO ) Cytokiny uplatňující se v humorální imunitě TH2 ( IL-4, 5, 9, 13 ) Cytokiny uplatňující se v buněčně zprostředkované imunitě TH1 ( IL- 2, 12, IFN, GM-CSF, lymfotoxin ) Cytokiny s antivirovým účinkem ( IFN-, IFN-IFN- )

Receptory cytokinů skládají se ze 2 až 3 podjednotek (jedna podjednotka váže cytokin, zbylé zprostředkovávají přenos signálu do buňky) signalizační podjednotka může být sdílena několika různými cytokinovými receptory (receptorová rodina) většina receptorů je asociována s proteinkinázami, chemokinové receptory jsou asociovány s trimerními G proteiny

Fyziologické imunitní regulační mechanismy

1) Regulace antigenem - vyvolání a vyhasnutí imunitní odpovědi - afinitní maturace B lymfocytů - udržení imunologické paměti - antigenní kompetice - prahová hustota komplexu MHC gpII-Ag na APC

2) Regulace antagonistickými peptidy agonista - antigenní peptid, který vyvolá plnohodnotnou odpověď T buněk (proliferace, diferenciace TH či TC a stimulace efektorových funkcí) antagonista - (částečný agonista) peptid strukturně podobný antigennímu peptidu, který vyvolává kvalitativně jinou odpověď T lymfocytů (např. produkce jen některých cytokinů, nebo anergie...) - negativní signály vyvolané antagonistou mohou překonat pozitivní signály vyvolané agonistou, který je v organismu v nadbytku - některé mikroorganismy tlumí reaktivitu T lymfocytů tím, že produkují mutantní formy svých proteinů, z nichž vznikají antagonistické peptidy - možnost terapeutického využití (transplantace, autoimunita, chronické záněty)

3) Regulace protilátkami - protilátky kompetují s BCR o antigen (negativní regulátor stimulace B lymfocytů) - imunokomplexy s IgG se váží na B lymfocyt na BCR a FcgR, důsledkem je blokování aktivace B lymfocytů - imunokomplexy s C3dg mají kostimulační účinky (C3dg se váže na CR2 na povrchu B lymfocytů) - zatím je nejasný význam regulace pomocí idiotypové sítě

Regulace cytokiny a mezibuněčným kontaktem Interakce APC - T lymfocyt Interakce TH1 – makrofág Interakce TH2 – B lymfocyt Vzájemná regulace aktivit TH1 versus TH2 Vývoj subpopulací leukocytů Negativní regulace efektorových lymfocytů: CTLA-4 inhibiční receptor T lymfocytů, váže ligandy CD80 a CD86 Inhibiční receptory NK buněk Sebedestrukční interakce apoptotického receptoru Fas s ligandem FasL na povrchu aktivovaných T lymfocytů

4) Regulace cytokiny a buněčným kontaktem 4a) Interakce APC s T lymfocytem T lymfocyt: TCR – antigenně specifický receptor (1. signál) CD4 nebo CD8 – koreceptory ( pro vazbu MHC gp) CD 28 – kostimulační receptor (2. signál, váže CD 80, CD 86) CTLA-4 – inhibiční receptor (váže CD 80, CD 86) CD 40L APC: MHC gp I + antigenní peptid MHC gp II + antigenní peptid CD 80, CD 86 – kostimulační ligandy CD 40

4a) Interakce APC s T lymfocytem Prekurzor TH , který rozpozná infikovaný makrofág a dostane signály přes TCR, CD 28, receptor pro IL-12 a další adhezivní a signalizační molekuly proliferuje a diferencuje se na efektorové TH1 buňky, které produkují IFNg a IL-2. IFNg podporuje přeměnu makrofágů v aktivované, které produkují NO (likvidace intracelulárních parazitů) a cytokiny IL-1, TNF...(stimulace lokálního zánětu). IL-2 je autokrinní růstový faktor TH1 lymfocytů. Prekurzor TH , který rozpozná infikovaný makrofág a dostane signály přes TCR, CD 28, receptor pro IL-4 a receptor pro IL-2 a další adhezivní a signalizační molekuly proliferuje a diferencuje se na efektorové TH2, které poskytují B lymfocytům pomocné signály pomocí sekretovaných cytokinů IL-4, IL-5, IL-6 a prostřednictvím adhezivních molekul CD 40L (váže se na kostimulační receptor B lymfocytů CD 40).

Interakce mezi APC a prekurzorem TH

4b) Vzájemná regulace aktivit TH1versus TH2 O tom, zda se prekurzorové TH lymfocyty budou vyvíjet v TH1 či TH2 rozhodne poměr cytokinů IL-12 a IL-4. - IL-12 je produkován makrofágy a dendritickými buňkami stimulovanými některými mikroorganismy IL-4 je produkován bazofily a mastocyty - cytokiny produkované TH1 (hlavně IFNg) inhibují vývoj TH2 a stimulují vývoj TH1 (IL-2 stimuluje i TH2) - cytokiny produkované TH2 (IL-4, IL-10) inhibují vývoj TH1 a stimulují vývoj TH2 - (vývoj TH3 je stimulován specifickým cytokinovým prostředím IL-4, IL-10, TGFb; produkují TGFb, spolupracují s B lymfocyty v MALT)

4c) Cytotoxické T lymfocyty Prekurzor TC , který rozpozná komplex MHC gp I- antigenní peptid na povrchu APC přes TCR a dostane signály přes CD 28 proliferuje a diferencuje se na klon zralých efektorových cytotoxických buněk. Toto probíhá za pomoci TH1 lymfocytů produkujících IL-2. Profesionální APC jsou dendritické buňky nebo makrofágy, které jsou infikovány virem, nebo pohltili antigeny z odumřelé virem infikované, nádorové nebo stresované buňky. Aby APC mohla aktivovat prekurzor TC ,musí být sama stimulována kontaktem s TH buňkami přes CD 40, poté začne dendritická buňka exprimovat CD 80, CD86 a sekretovat cytokiny (IL-1, IL-12). Přeměna klidové APC v aktivovanou. 4d) NK buňky NK buňky jsou schopny bez předchozí stimulace, proliferace a diferenciace zabíjet nádorové či virem infikované buňky. Mají na svém povrchu stimulační(Fc receptor CD16) a inhibiční receptory (imunoglobulinové, C lektinové), výsledná reakce závisí na tom, jaké signály převáží.

5) Suprese zprostředkovaná T lymfocyty - vzájemná negativní interakce TH1a TH2 zprostředkovaná cytokiny (TH2 lymfocyty produkují IL-4 a IL-10, které potlačují imunitní reakce založené na TH1 buňkách) - CD 8+ TS - supresorové T lymfocyty se zatím nepodařilo izolovat jako samostatnou subpopulaci ( pravděpodobně částečně identické s TC ) - negativně regulují aktivaci jiných T buněk (TH ,TC) - jako TS mohou působit anergické buňky, které kompetují s ostatními buňkami o stimulační IL-2

- rozpustné supresorové faktory - některé CD 8+ T lymfocyty produkují rozpustnou formu TCR - klonální eliminace či anergizace T lymfocytů po styku s antigenem na povrchu jiných buněk, než APC (chybí kostimulační signály), klonální eliminace je důležitá při vzniku tolerance k autoantigenům - regulační T lymfocyty (Tr1 CD 4+; podobné TH3), které produkují IL-10, pomáhají udržet toleranci k autoantigenům

6) Neuroendokrinní regulace - některé neurotransmitery působí na leukocyty (noradrenalin) - přímý kontakt volných nervových zakončení s mastocyty (bolest při degranulaci mastocytů) - některé endokrinní hormony působí na leukocyty (kortikosteroidy, růstový hormon, thyroxin, endorfiny...) - leukocyty produkují řadu hormonů (endorfiny, ACTH, TSH, růstový hormon...) - některé cytokiny působí na nervový systém (IL-1, IL-6, LIF, TNF) - vliv emocionálního stresu na imunitní systém

7) Faktory ovlivňující výsledek imunitní odpovědi Tentýž antigen může navodit aktivní imunitní odpověď nebo stav aktivní tolerance, výsledek odpovědi závisí na mnoha faktorech: - stavu imunitního systému - vlastnostech antigenu - dávce antigenu - způsobu podání

HLA systém (MHC glykoproteiny)

MHC glykoproteiny I. třídy (major histocompatibility complex) funkcí MHC gp. I. je prezentace peptidových fragmentů, které jsou produkovány buňkou, na buněčném povrchu tak, aby byly rozpoznávány T lymfocyty (cytotoxickými) přítomny na všech buňkách organismu 3 izotypy klasických lidských MHC gp. ( HLA - A, -B, -C ) - 3 izotypy neklasických MHC gp. ( HLA – E, -F, -G; molekuly CD1)

Struktura MHC gp. I - MHC gp. I. třídy se skládají z transmembránového řetězce a (45kDa) a nekovalentně asociovaného b2mikrotubulinu (12 kDa) řetězec a má 3 domény, 2 N-terminální (a1, a2 – vazebné místo pro peptidy) a 1 C-terminální doménu (a3 – zakotvena v cytoplazmatické membráně, struktura podobná imunoglobulinové doméně) vazebné místo pro peptid je strukturně význačná rýha, jejíž dno je tvořeno b strukturou a boky jsou ohraničeny 2 a šroubovicemi - vazba peptidu je nezbytná pro stabilní konformaci MHC gp. a tím zajišťuje jeho dlouhodobou prezentaci na buněčném povrchu

Vazba peptidů - MHC gp I. váží peptidy o délce 8 až 10 AK - určitá molekula MHC gp. váže peptidy sdílející společné strukturní rysy - vazebný motiv - důležitá je povaha AK poblíž konců peptidu - k vazbě endogenních peptidů dochází v endoplazmatickém retikulu během biosyntézy MHC gp. - po vytvoření řetězce a a b2mikrotubulinu dochází v ER k poskládání do správné konformace a k vzájemné asociaci a k asociaci vhodného peptidu, tento komplex je dále zpracován v Golgiho aparátu a pak je prezentován na buněčném povrchu - navázané peptidy pocházejí z proteinů degradovaných proteazómem, který štěpí cytoplasmatické proteiny určené k likvidaci (označené ubiquitinem), peptidové fragmenty jsou transportovány do ER pomocí specifických membránových pump

Vazba peptidů na MHC gp I

Vazba peptidů na MHC gp I

Neklasické MHC gp. I - HLA – E, -F, -G; molekuly CD1 - strukturně podobné klasickým MHC gp. - jsou méně polymorfní - vyskytují se jen na některých buňkách - specializují se na vazbu zvláštních ligandů

Neklasické MHC gp I HLA - E - vyskytuje se na mnoha typech buněk - váže signální (N- terminální) peptidy pocházející z prekurzorů HLA - A, -B, -C, -G HLA - G - vyskytuje se na buňkách trofoblastu - váže mnoho různých peptidů Komplexy HLA - E a HLA - G s peptidy jsou rozpoznávány inhibičními receptory NK buněk a přispívají k toleranci plodu v děloze. Molekuly CD1 - váží glykolipidy či jiné silně hydrofobní látky (mikrobiální či organismu vlastní), tyto komplexy jsou rozpoznávány specializovanými ab T lymfocyty.

MHC glykoproteiny II. třídy - funkcí MHC gp II je prezentace peptidových fragmentů z proteinů pohlcených buňkou tak, aby byly rozpoznatelné T lymfocyty (pomocnými) - vyskytují se na APC ( dendritické buňky, monocyty, makrofágy, B lymfocyty) - 3 izotypy MHC gp II ( DR, DQ, DP )

Struktura MHC gp. II - MHC gp. II se skládají ze 2 nekovalentně asociovaných transmembránových podjednotek a a b (molekulová hmotnost cca 30kDa) - vazebné místo pro peptid je tvořeno N-terminálními doménami a1 a b1 - vazba peptidu je nezbytná pro stabilní konformaci MHC gp. a tím zajišťuje jeho dlouhodobou prezentaci na buněčném povrchu

Vazba peptidů - MHC gp II váží peptidy o délce 15 až 35 AK (ale i delší - vazebné místo pro peptid je na obouch koncích otevřené) - určitá molekula MHC gp váže peptidy sdílející společné strukturní rysy - vazebný motiv - po vytvoření řetězce a a b v ER dochází k poskládání do správné konformace a k vzájemné asociaci a k připojení dalšího transmembránového řetězce, tzv. invariantního řetězce, který blokuje vazebné místo pro peptid, tento komplex je dále zpracován v Golgiho aparátu; sekreční váčky oddělené od GA fúzují s endozómy, poté se rozštěpí invariantní řetězce a do vazebného místa MHC gp se naváží peptidové fragmenty endocytovaných proteinů a poté je komplex prezentován na buněčném povrchu

Vazba peptidů na MHC gp II

Antigenní prezentace

Prezentace antigenu T lymfocytům Signál TCR – MHC gp I(II)+Ag peptid (APC) Signál kostimulační CD 28 (Tlymfocyt) – CD 80, CD 86 (APC)

Genový komplex MHC (HLA) - HLA komplex se nachází na chromozómu č.6 - obsahuje okolo 50 genů Obsahuje geny kódující: - MHC gp I a II - některé složky komplementu ( C2, C4, faktorB ) - některé cytokiny ( TNF ) - podjednotky proteazómu - podjednotky peptidových pump ( TAP ) - Hsp - jiné proteiny

Polymorfismus MHC glykoproteinů u MHC gp. je vysoký polymorfismus, tzn. existují až stovky různých alelických forem jednotlivých izotypů (kromě neklasických MHC gp. I a kromě DR řetězce a) - jednotlivé alelické formy mají zaměněnou 1 či více AK ve vazebném místě pro peptid kodominantní dědičnost alelických forem - jedinec má na povrchu buněk 3 izotypy HLA molekul (HLA-A, -B, -C) většinou ve 2 různých alelických formách

Polymorfismus MHC glykoproteinů polymorfismus má ochranný význam na úrovni jedince i na úrovni populace - polymorfismus MHC gp. způsobuje komplikace při transplantacích

HLA typizace = určení HLA antigenů na povrchu lymfocytů 1) Sérologická typizace - mikrolymfocytotoxický test - allospecifická séra ( získaná od vícenásobných rodiček do 6 týdnů po porodu, získaná vakcinací dobrovolníků, nebo komerčně připravené sety typizačních sér (monoklonální protilátky)) - princip - inkubace lymfocytů s typizačními séry za přítomnosti králičího komplementu, poté je přidáno vitální barvivo, které obarví mrtvé buňky - buňky nesoucí určité HLA jsou usmrceny cytotoxickými Ab proti tomuto Ag, procento mrtvých buněk je mírou toxicity séra (síly a titru antileukocytárních protilátek) - za pozitivní reakci se považuje více než 10% mrtvých bb. (sérologickou typizaci lze provádět i pomocí průtokové cytometrie)

2) molekulárně genetické metody - pro typizaci se používají hypervariabilní úseky ve II. exonu genů kódujících HLA II. třídy, pro určení HLA I. třídy se používá polymorfismus v II. a III. exonu kódujících genů 2a) PCR-SSP = polymerázová řetězová reakce se sekvenčními specifickými primery - extrahovaná DNA slouží jako substrát v sadě PCR reakcí - každá PCR reakce obsahuje primerový pár specifický pro určitou alelu (resp. skupinu alel) - pozitivní a negativní reakce se hodnotí elektroforézou - každá kombinace alel má svůj specifický elektroforetický obraz

2b) PCR-SSO = PCR reakce se sekvenčně specifickými oligonukleotidy - namnoží se hypervariabilní úseky genů kódujících HLA - hybridizace s enzymaticky nebo radioaktivně značenými DNA sondami specifickými pro jednotlivé alely 2c) PCR- SBT = sequencing based typing; sekvenování - nejpřesnější metodika HLA typizace - získáme přesnou sekvenci nukleotidů, kterou porovnáme s databází známých sekvencí HLA alel

NASHLEDANOU