Pátráme po mikrobech Díl VIII. Komplemetfixační reakce Ondřej Zahradníček K praktickému cvičení pro VLLM0421c Kontakty na mne: 777 031 969 zahradnicek@fnusa.cz ICQ 242-234-100

Co už umíme Umíme používat mikroskopii, kultivaci a biochemickou identifikaci Víme, jak bojovat s mikroby pomocí dekontaminačních metod a antimikrobiálních látek a umíme otestovat účinnost těchto postupů Víme, jak diagnosticky využít reakci antigenu s protilátkou, a víme, čím se liší precipitace, aglutinace a aglutinace na nosičích

Pohádka Byl jednou jeden zvědavý hlídač v parku. Chtěl vědět, jestli mládenec, který chodívá do parku ve stejnou dobu jako jedna slečna, k té slečně patří Uvažoval následovně: v parku je jediná lavička. Pokud patří k sobě, tak si jistě na lavičku sednou a budou se objímat Umístil proto na lavičku kudlibabky a řekl si, že pokud ti dva k sobě patří, nachytají na sebe při objímání kudlibabky z lavičky.

Jak to ale poznat… …když mládenec i dívka odešli jiným východem? Hlídač si uvědomil, že za chvíli přijde na návštěvu jeho neteř se svým přítelem. Jak je zná, určitě se cestou zastaví u lavičky a budou se objímat. Hlídač to vymyslel: pokud neteř s přítelem budou mít na sobě kudlibabky, pak je nevychytala ta první dvojice – žádná dvojice to nebyla. Pokud kudlibabky mít na sobě nebudou, tak k sobě první dvojice patří.

Poučení z naší pohádky Dnes máme na programu komplementfixaci, poměrně složitou reakci. Nejenže ke zviditelnění komplexu antigen-protilátka používáme komplement, ale navíc ještě přidáváme další dvě složky – tzv. indikátorovou dvojici. Tato dvojice je tvořena indikátorovým antigenem (beraní erytrocyty) a indikátorovou protilátkou (amboceptor = králičí protilátky proti beraním erytrocytům).

Typy metod – opakování Přímé metody: detekce mikroba, jeho části nebo produktu. Mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace, průkaz antigenu. Pozitivita = je jisté, že agens je NYNÍ přítomno. Nepřímé metody: detekce protilátek proti mikrobovi. Pozitivita = mikrob potkal hostitele v minulosti (nevíme, zda před týdny / měsíci / roky)

Antigen a protilátka – opakování Antigen = makromolekula pocházející z.cizího organismu: rostliny, mikroba, jiného živočicha. V mikrobiologii nás zajímají mikrobiální antigeny = části mikrobiálního těla, které vzbuzují v.hostiteli antigenní odpověď Protilátka = imunoglobulin, tvořený v.těle hostitele jako odpověď na antigenní výzvu (samozřejmě nejen u.člověka, ale i u zvířat)

Jak interakci využít – opakování Průkaz antigenu: laboratorní protilátky (zvířecího původu)+ vzorek pacienta nebo kmen mikroba. Přímá metoda Průkaz protilátky: laboratorní antigen (mikrobiální) + sérum (výjimečně sliny, likvor) pacienta Nepřímá metoda

Interpretace – doplněné opakování Průkaz antigenu je přímá metoda. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v těle pacienta Průkaz protilátek je nepřímá metoda. Jak odhadnout, kdy se mikrob s.tělem pacienta setkal: Množství protilátek (titr) a zejména změna tohoto množství (dynamika titru) Třída protilátek: IgM/IgG (více v J10) (Avidita protilátek)

1- akutní sérum Dynamika titru 2 - rekonvalescentní 2 1 Průšvih je, že každý má jinou úroveň protilátkové odpovědi. Proto samotná hodnota titru mnoho neříká Změna titru vypovídá více. Jde-li o čerstvou záležitost, titr se vždy vyvíjí, nejprve stoupá, později zvolna klesá. 2 1

Proč nestačí samotný titr Někdy se stane, že málo reaktivní pacient má i v akutní fázi titr dosti nízký Velmi reaktivní pacient naopak i dlouho po infekci titr relativně vysoký

Párová a nepárová séra Párová séra = první vzorek je uchováván v.ledničce, dokud nepřijde i druhý. Pak jsou oba hodnoceny naráz. čtyřnásobný vzestup se v tom případě má za signifikantní pro akutní infekci. Séra nejsou párová (druhý vzorek je vyšetřen zvlášť): zvětšuje se riziko náhodné, chyby, proto zpravidla vyžadujeme osminásobný vzestup titru

Dynamika titru – další aspekty Zvláštním případem je tzv. serokonverze – v prvním vzorku protilátky nejsou (ještě se nestihly vytvořit), v druhém už jsou. Takový důkaz je cennější než „důkaz čtyřnásobkem“ V některých případech místo vzestupu prokážeme pokles (subakutní infekce) Velikost titru rozhodně neodpovídá vývoji klinických příznaků. Množství protilátek často vrcholí, až příznaky zmizí.

Příklady různých projevů dynamiky titru 1 – 2: sérokonverze 3 – 4: vzestup titru 5 – 6: pokles titru 1 2 3 4 5 6

Komplementfixace (KFR) Komplement = jedna ze složek imunitní reakce Pro KFR používáme morčecí komplement. Pacientův komplement je před reakcí inaktivován Komplement není schopen vázat se na samotný antigen Komplement není schopen vázat se na samotnou protilátku Komplement je schopen vázat se pouze na KOMPLEX obou

Použití KFR KFR lze použít pro diagnostiku mnoha, zejména virových infekcí Jako i jiné serologické reakce se KFR používá k průkazu antigenu či protilátky Pro zjednodušení uvádíme v tomto praktiku pouze průkaz protilátky Berme to tedy tak, že máme laboratorní antigen, který konfrontujeme se sérem pacienta (kde hledáme protilátky)

Jak funguje komplement (Úkol 1) Amboceptor = králičí protilátka proti beraním erytrocytům Beraní ery + amboceptor bez komplementu  není hemolýza Beraní ery + komplement bez amboceptoru  není hemolýza Beraní ery + komplement + amboceptor  hemolýza Králičí ery + komplement + amboceptor  není hemolýza

Titrace komplementu (Úkol 2) Pro reakci potřebujeme množství morčecího komplementu, které není moc velké ani malé. Proto zjišťujeme, jaké množství komplementu hemolyzuje pracovní jednotku krvinek s.amboceptorem (hemolytická jednotka) Příliš mnoho komplementu  falešná negativita (příliš mnoho kudlibabek  zbude i na neteř a jejího přítele)

Titrace komplementu – výsledky Ředění morčecího séra (pro nás je zdrojem komplementu): 1 : 32 = hemolýza 1 : 36 = hemolýza 1 : 40 = hemolýza 1 : 44 = není hemolýza Hemolytická jednotka odpovídá 1 : 40 Abychom získali dvě jednotky, ředíme sérum 1 : 20

Princip KFR (Úkoly 3 a, b)

Problémy s KFR Příliš mnoho komplementu  falešná negativita. Co dělat? Titrovat komplement (viz Úkol 2) Některá složka séra sama o sobě vyvazuje komplement (složka antikomplementarity): falešně pozitivní výsledky. Co dělat? Provést test antikomplementarity bez antigenu (V pohádkovém příběhu odpovídá bezdomovci, který zválí lavičku a sám na sebe nachytá všechny kudlibabky)

Test antikomplementarity (Úkoly 3 c, d)

Úkoly 4: Respirační patogeny Celá serologická destička patří jednomu pacientovi. Máme šest respiračních patogenů, každý je ve dvou řádcích (akutní vzorek a rekonvalescentní). První sloupec je test antikomplementarity Následuje sedm ředění séra – ve druhém sloupci 1 : 5 a pak geometrickou řadou s.koeficientem dva. Kromě virů je ve škále i bakterie Mycoplasma pneumoniae

Úkol 5: Toxoplasmosa Destička patří pozitivní kontrole a šesti pacientům. Hledáme protilátky proti toxoplasmose. V tomto případě nesledujeme dynamiku titru, vypátráme pouze hodnotu titru (bez další interpretace) V prvním sloupci jsou opět testy antikomplementarity, následuje ředění geometrickou řadou od ředění 1 : 8

Úkol 6: Klíšťová encefalitida Opět testujeme protilátky, tentokrát proti klíšťové encefalitidě a tentokrát opět jako párové. V prvním sloupci jsou opět testy antikomplementarity, následuje ředění geometrickou řadou od ředění 1 : 4

Přeji Vám hezký zbytek dne… http://www.presse.uni-wuppertal.de/archiv/output/okt98