Tvorba genetické variability mutagenezí

Mutageneze = tvorba mutací - mutant Mutabilita genetické výbavy Schopnost genetické výbavy měnit své vlastnosti úzce souvisí s fyzikálně-chemickými vlastnostmi DNA a jejích stavebních složek Výsledek = proměnlivost genetické výbavy Vznik nových alel s odlišným účinkem na fenotyp Přestavby chromatinu a ztráty genů Aneuploidie a polyploidie

Tvorba výchozí variability Produkce rozmnožovacího materiálu Šlechtění rostlin NOVOŠLECHTĚNÍ Genetické zdroje Tvorba výchozí variability Hybridizace Mutageneze Transgenoze Udržovací šlechtění Výběrové systémy Produkce rozmnožovacího materiálu Registrace odrůdy

Pojem mutace Hugo de Vries (1848-1935) Objevil mutace u pupalky (Oenothera lamarckiana 2n=12) V potomstvu nalezl mutantu „gigas“ kterou nebylo možno křížit s ostatními rostlinami Jednalo se o autopolyploidní rostlinu s 2n=24.

Mutace na úrovni genu (přímá mutace) Aa AA A A a aa aa a

Zpětná mutace a aa aa a A A1 Aa A1a aa a

Členění mutací Přímá x zpětná Genová x chromozomová x genomická Spontánní x indukovaná Gametické somatické

Zdroje mutací Genové mutace Změny bází DNA v důsledku tautomerie bází imin - A Genové mutace Změny bází DNA v důsledku tautomerie bází Vznikají během replikace v souvislosti se selháním kontrolního aparátu enol - T enol - G imin - C

Zdroje mutací Přestavby chromozomů Změny struktury chromozomů Často vázány na meiózu a crossing overy Delece mohou vznikat i v průběhu replikace.

Zdroje mutací Aneuploidie a polyploidie Důsledky poruch mitózy a meiózy Důsledky hybridizace a somatické hybridizace

Anortopolyploidie 2n x 4n 3n

Polyploidizace křížením Hemerocallis fulva ‚Europa' 3n Hemerocallis fulva 'Ed Murray' 3n x 4n

Mutační šlechtění Záměrné využití mutagenů k indukci mutací s cílem rozšířit genetickou variabilitu výchozí generace šlechtění Podmínky úspěchu: Vegetativně množené - vitální somatické mutace Generativně množené – vitální mutace v buňkách zárodečné linie

Historie mutačního šlechtění Müller a Stadler (1927) detekce mutací na ječmeni a kukuřici Gaul (1963) a Gustafsson (1968) mutageneze ve šlechtění V ČR zaváděno v 60. až 70. letech Do 80. let mutageneze in vivo 1979 – zrušeno gamapole Od 80. let mutageneze in vitro

Vhodnost aplikace mutagenů Samosprašné Po aplikaci mutagenu na linie jsou jasně patrné rozdíly v genotypu Cizosprašné Aplikace mutagenů je vhodná na inbrední linie Vegetativně množené Cílem získat somatické mutace (udržitelné vegetativním množením

Indukce mutací Indukce pomocí mutagenů fyzikální a chemické povahy Aplikace mutagenů specifika biologického druhu cíl šlechtění mutaci vystavená část rostliny (semena, pyl, meristémy, kalusy, protoplasty)

Fyzikální mutageny Různé druhy záření Dávky Ionizující a, b, g, X, Neionizující UV záření, tepelné záření Dávky Subletální aplikace (chronické působení) Aplikace LD50 – 50% semen nebo pupenů odumírá v důsledku nevratného poškození genomu a buněk.

LD50 u různých plodin Hrách 1,29 – 3,87 C.kg-1 Ječmen 2,58 – 3,87 C.kg-1 Pšenice 3,87 – 5,16 C.kg-1 Řepka 6,45 – 12,90 Len 10,32 – 12,90 C.kg-1 Hořčice nad 25,80 C.kg-1 (1 coulomb/kg (C.kg-1) ~ 3876 R)

Ozařovací aparát

GAMA POLE – Japonský institut radiačního šlechtění Poloměr – 100 m Výkon – 88,8 TBq Zářič – 60Co www.irb.affrc.go.jp

Chemomutageny Methylmethanosulfonát (MMS) Ethylmethanosulfonát (EMS) Močovina a její deriváty N-methyl-N-nitrosomočovina N-ethyl-N-nitrosomočovina Epoxidy Alkaloidy (kolchicin) Peroxidy Formaldehyd

Aplikace chemomutagenů Namáčení roubů Aplikace na vegetační vrcholy Namáčení semen Zálivka In vitro kultivace v prostředí mutagenů Injekční aplikace do vodivých pletiv Působení podle koncentrace (20-30 minut)

Detekce mutací Makromutace x mikromutace Dominantní mutace – pozorované v M1 Recesivní mutace – až v M2 (25%) Musí být dědičné Přenáší se z generace na generaci

Mutace x malformace (morfóza) Změna v genotypu, přenášená z generace na generaci Morfóza změna tvarových vlastností rostliny nebo pletiva po aplikaci mutagenů

Mutace x malformace Morfózy – změny tvaru v důsledku různých metabolických poruch nebo patogenních procesů

Sektorové mutace - chimerismus Jsou somatického typu a nepřenáší se obvykle generativně Postižená rostlina = chiméra Somatická mutace révy vinné

Sektorové a pupenové mutace Vrstvy: I = dermatogen II = periblem III = plerom Vrstvy: I a II - tunika III - korpus

Chiméry u Saintpaulia ionantha 13 – Victorian ribbons 16 – Concord 28 – Hula Hoop

Mikromutace Mutace v polygenech – nelze jednoznačně detekovat Detekce se provádí na základě srovnání mutagenezi vystavených rostlin oproti výchozí generaci v pokusu.

Mutační šlechtění semenných rostlin X – ovlivnění osiva X 1 - výsev ovlivněného osiva X 2 – ramše, minimálně 20 semen X 3 – ověření vybraných rostlin X 4 – zkoušky výnosu (2 opakování) X 5 –7 – zkouška stability, odolnosti a výnosu mutantů (4 opakování)

Praktické výsledky mut. šlechtění Dle FAO: 2250 odrůd z mutageneze ve světě

Praktické výsledky mut. šlechtění

Praktické výsledky mut. šlechtění Diamant – (mutant odrůdy Valtický) Vanda – radiační mutant jahodníku Gorella (odolnost k plísni šedé) Gorella Vanda

Praktické výsledky mut. šlechtění Bor – radiační mutant chmele (reg. 1994) Yataka – červenoplodá odrůda jabloně (mutace odrůdy Fuji)

Mutační proces u třešně (Compact Stella) 3,5 – 4 kR g

Mutace v ovocnictví „compact Stella“ „Cumberland Spur“ Beztrnný ostružiník

Polyploidní šlechtění Šlechtění na úrovni polyploidních sad Spontánní polyploidie Indukovaná polyploidie Indukce polyploidů Zvýšení genetické variability Zvýšení objemu biomasy Eliminace semen (triploidy, aneuploidy) Evoluční studie

Indukce a detekce polyploidů Pomocí mitotických jedů (kolchicin, chloroform, acetnaften, oryzalin) Aplikace na semena (mixoploidie) Aplikace na gamety (květy) Protoplastové kultury, kalusy Detekce: Přímá detekce Nepřímá detekce – průtoková cytometrie

Detekce polyploidů Přímé metody: Nepřímé metody: Karyotypování – mikroskopické vyšetření Nepřímé metody: Průtoková cytometrie Měření svěracích buněk průduchů Počítání stomatárních chloroplastů

Detekce polyploidů Cytologické metody

Průtoková cytometrie Automatizované počítání jader označených fluorescenčním signálem.